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基因工程论文

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基因工程论文

篇1：基因工程论文

基因工程论文

基因工程论文：浅谈基因工程在农业生产中的应用

摘要:基因工程在农业生产上已经被十分广泛地应用。基因技术的突破,使科学家们得以传统育种专家难以想象的方式,改良动植物,大大提高了经济效益。

关键词:基因;应用

基因在农业生产上的应用已经非常广泛,但其中的道理未必广为人知。那么所谓基因到底是什么呢?它是控制生物性状的基本单位,记录着生物生殖繁衍的遗传信息。并且通过修改基因能改变一个有机体的部分或全部特征。它的作用主要是以转基因技术和基因克隆技为核心。通过它们改良动植物的品种,从而大大提高经济效益。那么下面我们就谈谈它们是怎样为人类服务的呢?

一、转基因技术

转基因技术就是按照人们预先设计的生物蓝图,把所需要的基因从一种生物的细胞提取出来,在体外进行“外科手术”,然后把所需要的基因导入另一种生物的细胞中,从而有目的地改造生物的遗传特性,创造出符合人类需要的新品种。转基因技术能培养出多种快速生长的转基因鱼、转基因羊、产奶量高的转基因牛等,还能培育出抗旱、抗涝、抗盐碱、抗枯萎病和抗除草剂的转基因作物,还培育出抗虫作物,科学家将杀虫基因转入植物体内后,植物体内就能合成霉素蛋白,产生这种霉素蛋白基因的作物有烟草、马铃薯、番茄、棉花和水稻等,其中效益最大的是抗虫棉。

二、基因克隆技术

“多莉的诞生”意味着人类可以利用动物的一个组织细胞,像翻录磁带或复印文件一样,大量生产出相同的生命体。利用它可以拯救濒临灭迹的物种,或是复制一些优良品种等等。然而在进一步细想克隆,却也着实让人深虑。首先,若是无节制地“复制”某种物种,就会打破自然界的生态平衡,破坏优胜劣汰的自然法则,给自然界带来了混乱。其次,从理论上说“克隆”哺乳动物的成功,即为“克隆”人类准备了前提条件,再经过技术的不断改善,毫无疑问,不久以后就能“克隆”出人。对此杭州大学生命科学院院长、浙江省生物工程学会副理事长黄纯农教授认为,不必过分担心。他说,当前“克隆”技术还有完善的过程,暂时达不到大量“复制”人的地步。再者各地已相继制定了法令,为“克隆”人进行限制。当然,“克隆”技术的.产生,归根到底是利大于弊,它将被广泛应用于人类,前景灿烂,方兴未艾。科学的进步和人的观念的变化,是无法阻止的。

三、应用基因技术的优点

从前面可以看出,基因技术的突破,是科学家得以用传统育种专家难以想象的方式改良动植物品种,其优点是显而易见的。第一,可降低生产成本。一个品种的基因加入另一种基因,会使该品种特性发生变化,具备原品种所不具备的因子,从而增强了抗病、抗杂草或抗虫害能力。由此可减少植物农药和除草剂的用量,降低种植成本。并且动物死亡率明显降低,从而提高养殖业的经济效益。第二,可提高动植物产量。一种动植物的基因改良后,更容易适应环境,能更有效抵御各种灾害的袭击,并使产量更高。第三,转基因技术可以使开发动植物的时间大为缩短。利用传统的育种方法,需要七、八年时间才能培育出一个新的品种,而基因工程技术培育出一种全新的动植物品种,时间可缩短一半。因此,有专家认为,不出多少年,转基因技术将改变世界。第四,转基因技术还可根据人们的需要,赋予农作物新的特性。例如可以使农作物自己释放出杀虫剂,可以使农作物在旱地或盐碱地上生长,或者生产出营养更为丰富的食品。科学家还利用转基因技术,开发能够生产防病的疫苗和食品的农作物。

总之,基因技术虽然说是有利,也有弊,但是毕竟利大于弊,因此被广泛应用。并且科学家们还在继续深入研究它,努力更好地、更多地、更快地为人民服务。我们大家也要争取加入其中啊。

篇2：基因工程的论文

有关基因工程的论文

摘要：综述转基因技术在提高农作物抗生物/非生物胁迫中的能力，以及在改良农作物遗传品质等方面的作用，并提出了做好安全监管工作的建议，使转基因技术为人类带来更多福祉。

关键词：农作物；转基因技术；农业发展

农业转基因技术就是打破不同物种间天然杂交的屏障，将高产、抗胁迫、高营养品质等已知功能的基因利用分子生物学技术转移到目的农作物体内，使其在原有遗传基础上获得新的功能特性，来提高农作物的抗胁迫能力或某种营养成分的含量，从而获得新的农作物品种，进一步能满足人类的需要。自从首例转基因作物于1983年问世以来，近年来农作物转基因已获得了蓬勃的发展，截止转基因农作物在全球种植面积已达1.81亿hm2。目前转基因技术已渗透到农业生产的方方面面，如利用转基因技术提高植物的抗逆性、抗病虫害等能力，对于农业转基因技术而言可以说已经进入以抢占技术制高点与经济增长点为目标的战略机遇期，已渗透到农业生产的方方面面。

1转基因技术促进作物抗病虫害作用

通过分子生物学技术获得抗病虫害基因再利用转基因技术导入到农作物的体内，使目的作物表现出相应的抗病虫害的特性。早在19就从染病的家蚕体液中分离出一种对部分鳞翅目（Lepidoptera）昆虫幼虫具有毒杀作用的苏云金芽孢杆菌，即现在所说的Bt。Bt在芽胞形成过程中，可产生具有杀虫作用的晶体蛋白（即δ-内毒素，δ-endotoxins），将编码这种蛋白的基因转入农作物将对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多种昆虫的幼虫以及无脊椎动物有特异的毒杀作用，这是关于利用转基因技术来提高农作物抗病虫害的最早起源。目前采用转基因技术来提高植物的抗病虫害能力已延伸到了烟草、棉花及水稻当中，并取得了不错的成果，如英国已将豇豆种子中的胰蛋白酶抑制剂基因（即产物为胰蛋白酶抑制剂）转入烟草，通过引起多种昆虫消化不良，达到抗虫作用。利用转基因技术来提高农作物的抗病性源于1986年美国将烟草花叶病毒（TMV）的病毒外壳蛋白基因转入烟草，从而使转基因烟草及其后代表现出对TMV的抗性。目前主要采用反义RNA技术或转基因技术使农作物获得抗病性，现已通过分子生物学技术已克隆获得了多种与抗病的.相关基因：如水稻矮缩病毒的外壳蛋白基因[1]、抗黄萎病的枯萎几丁质酶基因[2]，研究证实这些基因可直接或间接提高转基因系作物对病害胁迫的耐受性。

2转基因技术提高植物抗非生物胁迫作用

农作物在生长发育过程中不可避免地会受到外界环境的影响，如盐碱、旱高温、低温等非生物胁迫。这些非生物胁迫会引起作物体内发生一系列的生理生化反应，如常表现为植物生长代谢的可逆性抑制，但严重时则会导致整株植物死亡。近年来我国在耐盐基因工程研究方面已取得了较大进展，已克隆到了山菠菜碱脱氢酶、脯氨酸合成酶等与耐盐相关的酶的基因，将这些基因转入作物体内，可提高植物细胞的渗透压，从而可增强作物的抗盐能力，目前通过遗传转化获得的耐盐转基因烟草、草莓和苜蓿等植物已进入田间试验阶段[3]。另外，通过转基因技术提高作物抗除草剂能力可直接节省通过化学方法来控制杂草的开支，据估计美国每年用在除草剂上的开支约为50亿美元。抗除草剂转基因作物的研究和推广一直以来都是转基因领域的研究热点，目前全球已成功开发并商业化的抗除草剂转基因作物主要有玉米、水稻、大豆、烟草、甜菜、棉花等，部分作物已开始大面积种植，如玉米、大豆、棉花等。抗除草剂转基因作物在～间对全球转基因作物增长的贡献最大，占所有转基因作物种植面积的69%。

3转基因技术改良作物遗传品质

优质农作物一直以来都是全人类追求的目标，转基因技术可以帮助人类将这一目标变为现实。通过转基因技术改良作物的遗传品质多数是将能合成特定产物的基因转入植物体内，使其种子或其他贮藏器官如块茎、块根等中蛋白质含量、氨基酸组成、多糖化合物组成等得到改进。目前已发展了异源蛋白基因的转移和表达、同源蛋白基因的过量表达以及增加游离的必需氨基酸的含量等改良作物蛋白质营养价值的分子生物学方法。如将高赖氨酸蛋白基因引入小麦能使其种子中蛋白质及其赖氨酸的比例都提高10%以上[4]；将什曼原虫的蝶呤还原酶（PRT1）转入拟南芥和烟草中能在一定程度上提高植物叶酸的含量[5]；华中农大和中科院植物研究所已分别获得了延迟成熟的转基因番茄，储藏时间长达1～2个月，甚至80d以上[6]，能降低番茄在运输、储藏时的经济损失；另外目前已获得富含叶酸、维生素C和高花青素的西红柿等。

4结语

综上所述，转基因技术极大促进了农业生产的发展，为解决全球不断增长的粮食需求和保障农业可持续发展发挥了重要作用。由ISAAA的统计报告可知，至通过种植转基因作物增加的农作物产量价值达982亿美元，节省土地1.087亿hm2，杀虫剂使用减少4.73亿kg，有效保护了生态环境和生物多样性[7]，所以众多学者发出“反转误国”之声。本文通过分析转基因技术在农业生产中运用发现，转基因技术在作物改良上已表现出比常规育种和诱变育种的优势，的确能够为人类创造更多收益。不过目前关于转基因农作物是否对人体存在危害仍然没有一个明确的答案，因此不能以偏概全对待转基因农作物。为了确保安全，可开发和应用安全标记基因以减少公众对抗性标记基因可能带来的潜在危害的担扰；同时要进一步开发新技术尽可能减少转基因技术所存在的不如意的地方，如可采用叶绿体基因工程，该技术在安全、高效转基因方面有突出表现[8-9]，能将外源基因准确、高效地插入。目前叶绿体转基因已在拟南芥[10]、烟草[11]、马铃薯[12]等作物中获得了成功。当然在做好安全工作的同时，要分类别对待转基因技术。对能够显著提高作物优良遗传品质和农艺性状的、人类不需要直接食用的且已获得安全证书的转基因作物的种植可扩大；而对于需要直接食用的转基因作物则应当审慎监管，毕竟转基因作物可能是一把双刃剑，在为公众带来巨大收益和回报的同时，也有可能对生命安全存在着潜在危险。为了让全球农业种植者获得更大收益，转基因作物的发展和推广就要在相关部门的监管和支持下做到更透明可控，为社会发展和人类健康带来更大的福祉。

参考文献

[1]李胜，刘慧君，陈章良，等.水稻矮缩病毒外壳蛋白基因S8在昆虫细胞中的表达[J].微生物学报，，41（2）:162-166.

[2]夏启玉，王宇光，孙建波，等.一株拮抗香蕉枯萎病的内生细菌的分离及其几丁质酶基因信号肽的分泌活性分析[J].中国生物工程杂志，，30（9）：24-30.

[3]魏玉清，许兴.植物转基因技术及其应用[J].宁夏农林科技，（4）：41-44.

[4]孙晓波，房瑞，余桂红，等.转高赖氨酸含量基因（Cflr）小麦植株的获得及种子中蛋白质和赖氨酸的含量分析[J].江苏农业学报，2010（16）:1162-1169.

[5]鹿晔，刘晓宁，姜凌，等.过表达蝶呤还原酶PTR1基因促进植物叶酸合成的研究[J].中国农业科技导报，（14）：49-56.

[6]Herrera-EstrellaL，VandenBroeckG，MaenhantR，etal.Light-inducibleandchloroplast-associatedexpressionofachimaericgeneintroducedintoNicotianatobacumusingaTi-plasmidvector[J].Nature，1984，310:115-120.

[7]JamesC.Globalstatusofcommercializedbiotech/GMcrops:2012[J].InternationalServicefortheAcquisitionofAgri-biotechApplications，，ISAAABriefNo.44.

[8]StaubJM，CarciaB，GravesJG，etal.High-yieldproductionofahumantherapeuticproteinintobaccochloroplasts[J].NatBiotech，，18:333-338.

[9]黎昊雁，王玮.新一代转基因植物研究进展[J].中国生物工程志，2003，23（6）:22-26.

[10]SikdarSR，SerinoG，ChaudhuriS，MaligaP.Plastidtransformationinarabidopsisthaliana[J].PlantCellRep，1998，18:20-24.

[11]SvabZ，HajdukiewiczP，MaligaP.Stabletransformationofplastidsinhigherplants[J].ProcNatlAcadSciUSA，1990，87:8526-5830.

[12]SidorovVA，KastenD，PangSZ，etal.Stablechloroplasttransformationinpotato:useofgreenfluorescentproteinasaplastidmarker[J].PlantJ，，19（2）:209-216.

篇3：基因工程相关研究参考论文

基因工程相关研究参考论文

首先获得需要生产的蛋白质药物的目的基因，然后选择合适的运载体(多以病毒)并与运载体结合形成重组DNA分子，再将重组DNA分子转入受体生物(动物或植物)内，从而得到生物反应器。

(3)实例：动物乳腺生物反应器。

操作大致过程为：获取目的基因→ 构建基因表达载体→显微注射导入哺乳动物受精卵中→形成胚胎→将胚胎送入母体动物→发育成转基因动物(只有在产下的雌性个体中，转入的基因才能表达)。

因为动物所有的体细胞都是由受精卵发育成的，故其乳腺细胞中含有重组基因并进行选择性表达，产生出抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素等重要的医药产品。

4．蛋白质工程(prtein engineering)

(1)概念：利用基因工程的技术，对天然蛋白质进行改造，以便获得具有理想生物学功能的蛋白质。

蛋白质工程可以创造新的、自然界不存在的蛋白质分子。

目前，蛋白质工程主要是改造现有的蛋白质，通过修改蛋白质中的氨基酸序列来改进蛋白质的结构和构象，提高蛋白质的活性、稳定性和产率。

也可以利用基因工程改造蛋白质。如下方法：

预期蛋白质功能→设计预期的.蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)。

(2)与基因工程的关系

蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，是第二代基因工程。

基因工程的实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，产生本不能产生的蛋白质，从而产生新性状。原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。

蛋白质工程的目的：生产符合人们生活需要的并非自然界已存在的蛋白质。

二、基因工程的未来

基因工程是一种新鲜的事物，也是一把“双刃剑”，人们对此会有不同的看法。只要科学地、合理地加以利用，相信基因工程一定会使我们的生活更美好。

纲举目张理清结构

基因工程的研究在动植物育种、人类疾病防治及生态保护方面取得了一定的成就，但科学家永不放弃研究，又致力于新的尝试，努力使基因工程为人类提供更大的帮助。

突破难点化解疑点

1．分析说明基因工程应用研究的实质。

探究发现：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以生产它本不能生产的蛋白质，进而表现出新的性状。

基因工程可以发生在不同植物之间、不同动物之间以及微生物与动植物之间。目的基因位于微生物体内，可以转基因至植物或动物体内，如植物的抗性基因大多于细菌或病毒；目的基因位于动物体内，如动物的生长激素基因、胰岛素基因等可转移至细菌中大量生产；当然在植物与植物之间、动物与动物之间更容易发生。

不同的生物甚至亲缘关系比较远的生物之所以能发生基因重组，是由于各种生物基因的结构基本相同，在遗传上共用一套遗传密码。

我的发现

2．蛋白质工程与基因工程有何关系？

探究发现：简单地讲，蛋白质工程就是根据蛋白质的精细结构和生物活力的作用机制之间的关系，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至于创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。蛋白质工程在诞生之日起就与基因工程密不可分。基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品还是该基因编码的天然存在的蛋白质。蛋白质工程则更进一步根据分子设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改造，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的，具有了人类所需要的优点的蛋白质。天然蛋白质都是通过漫长的进化过程自然选择而来的，而蛋白质工程对天然蛋白质的改造，好比是在实验室里加快了的进化过程，期望能更快、更有效地为人类的需要服务。

基因工程是遵循中心法则，从DNA→RNA→蛋白质→折叠产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。

蛋白质工程是直接改造天然蛋白质或按照以下思路进行：确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→应有的碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。

篇4：基因工程的论文

摘要：综述转基因技能在进步农作物抗生物/非生物钳制中的才能，以及在改善农作物遗传质量等方面的效果，并提出了做好安全监管作业的建议，使转基因技能为人类带来更多福祉。

关键词：农作物；转基因技能；农业开展

农业转基因技能就是打破不同物种间天然杂交的屏障，将高产、抗钳制、高养分质量等已知功用的基因使用分子生物学技能搬运到意图农作物体内，使其在原有遗传基础上取得新的功用特性，来进步农作物的抗钳制才能或某种养分成分的含量，然后取得新的农作物品种，进一步能满意人类的需要。自从首例转基因作物于1983年面世以来，近年来农作物转基因已取得了蓬勃的开展，截止转基因农作物在全球栽培面积已达1.81亿hm2。现在转基因技能已渗透到农业生产的方方面面，如使用转基因技能进步植物的抗逆性、抗病虫灾等才能，关于农业转基因技能而言能够说已经进入以抢占技能制高点与经济增长点为目标的战略机遇期，已渗透到农业生产的方方面面。

1转基因技能促进作物抗病虫灾效果

经过分子生物学技能取得抗病虫灾基因再使用转基因技能导入到农作物的体内，使意图作物表现出相应的抗病虫灾的特性。早在19就从染病的家蚕体液中别离出一种对部分鳞翅目（Lepidoptera）昆虫幼虫具有毒杀效果的苏云金芽孢杆菌，即现在所说的Bt。Bt在芽胞构成过程中，可产生具有杀虫效果的晶体蛋白（即δ-内毒素，δ-endotoxins），将编码这种蛋白的基因转入农作物将对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多种昆虫的幼虫以及无脊椎动物有特异的毒杀效果，这是关于使用转基因技能来进步农作物抗病虫灾的最早来源。现在选用转基因技能来进步植物的抗病虫灾才能已延伸到了烟草、棉花及水稻当中，并取得了不错的成果，如英国已将豇豆种子中的胰蛋白酶按捺剂基因（即产物为胰蛋白酶按捺剂）转入烟草，经过引起多种昆虫消化不良，到达抗虫效果。使用转基因技能来进步农作物的抗病性源于1986年美国将烟草花叶病毒（TMV）的病毒外壳蛋白基因转入烟草，然后使转基因烟草及其后代表现出对TMV的抗性。现在主要选用反义RNA技能或转基因技能使农作物取得抗病性，现已经过分子生物学技能已克隆取得了多种与抗病的相关基因：如水稻矮缩病毒的外壳蛋白基因[1]、抗黄萎病的枯萎几丁质酶基因[2]，研讨证实这些基因可直接或间接进步转基因系作物对病害钳制的耐受性。

2转基因技能进步植物抗非生物钳制效果

农作物在成长发育过程中不可避免地会受到外界环境的影响，如盐碱、旱高温、低温等非生物钳制。这些非生物钳制会引起作物体内发生一系列的生理生化反响，如常表现为植物成长代谢的可逆性按捺，但严重时则会导致整株植物死亡。近年来我国在耐盐基因工程研讨方面已取得了较大进展，已克隆到了山菠菜碱脱氢酶、脯氨酸合成酶等与耐盐相关的酶的基因，将这些基因转入作物体内，可进步植物细胞的渗透压，然后可增强作物的抗盐才能，现在经过遗传转化取得的耐盐转基因烟草、草莓和苜蓿等植物已进入田间试验阶段[3]。别的，经过转基因技能进步作物抗除草剂才能可直接节约经过化学方法来控制杂草的开支，据估计美国每年用在除草剂上的开支约为50亿美元。抗除草剂转基因作物的研讨和推行一直以来都是转基因范畴的研讨热门，现在全球已成功开发并商业化的'抗除草剂转基因作物主要有玉米、水稻、大豆、烟草、甜菜、棉花等，部分作物已开始大面积栽培，如玉米、大豆、棉花等。抗除草剂转基因作物在～间对全球转基因作物增长的贡献最大，占一切转基因作物栽培面积的69%。

3转基因技能改善作物遗传质量

优质农作物一直以来都是全人类寻求的目标，转基因技能能够协助人类将这一目标变为现实。经过转基因技能改善作物的遗传质量多数是将能合成特定产物的基因转入植物体内，使其种子或其他储藏器官如块茎、块根等中蛋白质含量、氨基酸组成、多糖化合物组成等得到改善。现在已开展了异源蛋白基因的搬运和表达、同源蛋白基因的过量表达以及添加游离的必需氨基酸的含量等改善作物蛋白质养分价值的分子生物学方法。如将高赖氨酸蛋白基因引进小麦能使其种子中蛋白质及其赖氨酸的比例都进步10%以上[4]；将什曼原虫的蝶呤还原酶（PRT1）转入拟南芥和烟草中能在必定程度上进步植物叶酸的含量[5]；华中农大和中科院植物研讨所已别离取得了延迟老练的转基因西红柿，储藏时间长达1～2个月，乃至80d以上[6]，能降低西红柿在运送、储藏时的经济损失；别的现在已取得富含叶酸、维生素C和高花青素的西红柿等。

4结语

综上所述，转基因技能极大促进了农业生产的开展，为解决全球不断增长的粮食需求和保证农业可持续开展发挥了重要效果。由ISAAA的计算陈述可知，至经过栽培转基因作物添加的农作物产量价值达982亿美元，节约土地1.087亿hm2，杀虫剂使用削减4.73亿kg，有效维护了生态环境和生物多样性[7]，所以很多学者宣布“回转误国”之声。本文经过分析转基因技能在农业生产中运用发现，转基因技能在作物改善上已表现出比惯例育种和诱变育种的优势，的确能够为人类创造更多收益。不过现在关于转基因农作物是否对人体存在损害依然没有一个清晰的答案，因而不能以偏概全对待转基因农作物。为了确保安全，可开发和应用安全符号基因以削减大众对抗性符号基因或许带来的潜在损害的担扰；一起要进一步开发新技能尽或许削减转基因技能所存在的不如意的当地，如可选用叶绿体基因工程，该技能在安全、高效转基因方面有突出表现[8-9]，能将外源基因精确、高效地插入。现在叶绿体转基因已在拟南芥[10]、烟草[11]、马铃薯[12]等作物中取得了成功。当然在做好安全作业的一起，要分类别对待转基因技能。对能够显著进步作物优良遗传质量和农艺性状的、人类不需要直接食用的且已取得安全证书的转基因作物的栽培可扩大；而关于需要直接食用的转基因作物则应当审慎监管，毕竟转基因作物或许是一把双刃剑，在为大众带来巨大收益和回报的一起，也有或许对生命安全存在着潜在危险。为了让全球农业栽培者取得更大收益，转基因作物的开展和推行就要在相关部门的监管和支持下做到更透明可控，为社会开展和人类健康带来更大的福祉。

参考文献

[1]李胜，刘慧君，陈章良，等.水稻矮缩病毒外壳蛋白基因S8在昆虫细胞中的表达[J].微生物学报，，41（2）:162-166.

[2]夏启玉，王宇光，孙建波，等.一株拮抗香蕉枯萎病的内生细菌的别离及其几丁质酶基因信号肽的分泌活性分析[J].我国生物工程杂志，，30（9）：24-30.

[3]魏玉清，许兴.植物转基因技能及其应用[J].宁夏农林科技，（4）：41-44.

[4]孙晓波，房瑞，余桂红，等.转高赖氨酸含量基因（Cflr）小麦植株的取得及种子中蛋白质和赖氨酸的含量分析[J].江苏农业学报，2010（16）:1162-1169.

[5]鹿晔，刘晓宁，姜凌，等.过表达蝶呤还原酶PTR1基因促进植物叶酸合成的研讨[J].我国农业科技导报，（14）：49-56.

[7]JamesC.Globalstatusofcommercializedbiotech/GMcrops:2012[J].InternationalServicefortheAcquisitionofAgri-biotechApplications，，ISAAABriefNo.44.

[8]StaubJM，CarciaB，GravesJG，etal.High-yieldproductionofahumantherapeuticproteinintobaccochloroplasts[J].NatBiotech，，18:333-338.

[9]黎昊雁，王玮.新一代转基因植物研讨进展[J].我国生物工程志，2003，23（6）:22-26.

[10]SikdarSR，SerinoG，ChaudhuriS，MaligaP.Plastidtransformationinarabidopsisthaliana[J].PlantCellRep，1998，18:20-24.

[11]SvabZ，HajdukiewiczP，MaligaP.Stabletransformationofplastidsinhigherplants[J].ProcNatlAcadSciUSA，1990，87:8526-5830.

[12]SidorovVA，KastenD，PangSZ，etal.Stablechloroplasttransformationinpotato:useofgreenfluorescentproteinasaplastidmarker[J].PlantJ，，19（2）:209-216.

篇5：基因工程的应用论文

基因工程的应用论文

知识目标：

①举例说出基因工程在农牧业、医药、环境保护等领域的应用；

②关注转基因生物和转基因食品的安全性；

2.能力目标：

①通过辩论前准备，提高搜集资料、筛选信息的能力；

②通过辩论，训练思维能力，口语表达能力，增强合作意识；

3.态度与情感价值观目标：

①了解目前转基因生物与转基因食品现状，同时客观对待基因工程技术及其产物；

②建立科学、严谨、为人类谋福利的主体科学思想；

③注重养成尊重他人、待人有礼的品德。

在例举基因工程各种应用的基础上，重点引导学生举行辩论赛的方式讨论基因工程应用的利与弊。布置学生搜集相关资料，采取思考、分析、想象、推断和辩论相结合的方法，探讨基因工程的利与弊。对于这个问题，教师不必刻意将学生的争论引向一致的结论，辩论的过程本身就是对学生思维的训练，能够给予学生不少启发。

最后，教师应该强调科学技术是一把双刃剑，既可以为人类造福，有可能造成一些负面影响，所以，大家在看待转基因生物与食品问题上，一方面我们要看到它有利的一面，另一方面尽可能地避免有害的一面。身为现代公民，应该时刻关注科学技术的发展和影响。

提问：什么是基因工程？

动画分�i演示基因工程四步骤：

1、提取目的基因；

2、目的基因与运载体结合；

3、将目的基因导入受体细胞；

4、目的基因的检测与鉴定。

设计意图：复习所学内容，唤起学生记忆。理解，分析各步骤之间的关系。同时在脑海中形成完整的基因工程流程吸引学生注意力。

a、简要地介绍基因工程在农业、食品、医药、环境保护等领域的应用；

b、观看视频：市民对转基因生物和食品的态度，过渡到学生辩论；

c、学生辩论：转基因生物与食品出现是利大于弊，还是弊大于利。

设计意图：训练学生的思维能力，口语表达能力，培养学生合作意识。有利于增加学生和学生之间、学生与老师之间的交流，取长补短，共同提高。

a、评选一位最佳辩手；

b、教师评述本场辩论赛。设计意图：鼓励辩手，肯定辩手们的努力

总结：大家看待转基因生物与食品问题，一方面要看到它有利一面，另一方面尽可能避免有害的一面。身为现代公民，应该时刻关注科学技术的发展和影响。

1、基因工程中涉及很多抽象的分子生物学的技术，运用分�i动画演示、DNA的剪切和拼接的`模拟实验，让学生对整个基因工程操作过程形成正确认识很有必要；

2、以学生辩论赛的形式普及转基因生物与食品利与弊问题，学生的个人能力也得到了提高，主要有几点：

①有利于参赛选手能力的提高。首先，在赛前准备时，学生会通过多种途径查找材料，学会了多角度思考问；学生查找信息的能力，思维的深刻性、论证性和敏捷性都得到了提高；其次，语言表达更具艺术性。第三，知识结构更完备。

②有利于班级凝聚力的增强。辩论不仅是个人才华的展示，一个优秀的团体能够脱颖而出离不开四人小团体的默契，更离不开大集体班级同学的支持。比赛让他们走得更近，更像一家人；

③有利于增加学生和学生之间、学生与老师之间的交流。辩论赛不仅设有陈述观点环节、提问应答环节、自由辩论环节、总结称词环节，还设有观众互动环节。在辩论赛中，辩手与辩手之间、观众与辩手之间、观众与观众之间、评委与辩手之间，大家相互交流，取�L补短，共同提高；

3、课堂教学的设计思路，教材内容的适当调整，教学手段的多样化等方面体现了特色创新教育、体现了素质教育，在教学过程中从多个角度渗透德育教育；

4、在课堂中，可以感受到学生辩论的激情，正反方都踊跃表达自己的观点。同时，也能了解学生的思维与知识面与老师不同的地方，在整个辩论过程中，老师也了解了不少关于转基因生物与食品出现是利大于弊，还是弊大于利的知识，增长了见识，更进一步了解了转基因生物和转基因食品的安全性问题，课堂要组织有序，紧张活泼，有张有弛，能够做到教学相长、师生受益，教学效果较显著。

篇6：基因工程制药的研究论文

基因工程在生物制药领域的主要应用是基因工程制药。基因工程制药是指人们按照一定的医学目标，将特定的外源基因导入宿主的基因组成，由宿主产生特定蛋白药物的一种制药方式。

1基因操作技术

1.1基因大分子分离技术基因大分子分离技术实际上是指基因组DNA和质粒（plasmidDNA）的分离。基因组DNA分离的方法主要有PCR扩增技术、Southern杂交等。其中，基因文库是建立在DNA重组基础上的，它不同于基因克隆和基因库，主要是指将某种重组的DNA序列在某宿主体内进行克隆增值。质粒分离的方法主要包括酸酚法、质粒DNA释放法和去污裂解法等。质粒通常被用作基因工程中的表达载体或克隆载体。

1.2技术PCR技术是一种在细胞外模拟DNA复制过程的核酸扩增技术。PCR技术可以分为定量PCR技术和定性PCR技术。定量PCR技术是以实时PCR为代表，其基本原理是将荧光标记分子引入PCR反应体系中，以此实现对反应过程中每一时刻的荧光信号积累的实时检测，并计算PCR的产物量，或借助标准曲线法实现对初始模板量的计算。PCR技术分为反转录PCR、反向PCR、锚定PCR和多重PCR。反转录PCR（RT-PCR）是一种利用极少量的mRNA来构建庞大数量的cDNA文库的方法。

1.3基因芯片技术基因芯片实际上是生物芯片中的一种。该技术主要包括样品的制备、核酸方阵的构建和杂交、杂交图谱的检测和读出。根据用途的不同，又可以将基因芯片技术分为诊断芯片技术、测序芯片技术和表达谱芯片技术。其中，表达谱芯片技术作为一种应用最广泛的技术，它不仅可以用于药物的研究和筛选，还可以应用于分析基因的供能和探讨疾病的发生机制等方面。就该技术的具体应用而言，它主要包括以下两方面：①确定药靶基因。将正常的人体细胞与病变或异常的细胞作对比，并找出其中的差异，从而确定药靶基因。②实时监测药物治疗前后的基因状态。

检测基因表达有三方面的作用：①通过监测基因用药前后的基因表达状况，可以了解药物作用的机理及其对细胞的影响。②可以实现对药物毒理的研究。③有助于药物筛选。

1.4外源基因导入技术外源基因导入技术是将合成的新型基因导入宿主细胞中，然后通过基因在宿主体内的表达，由宿主产出有关的蛋白质药物。根据宿主细胞类型的不同，可以将基因的表达分为真核细胞表达系统和原核细胞表达系统。外源基因在宿主细胞内表达时，通常会将一个目的蛋白的基因与一个报告蛋白的基因相互融合，即形成融合蛋白，从而用于蛋白的纯化和检测。常用的报告蛋白有硫氧还蛋白、谷胱甘肽S-转移酶和β-半乳糖苷酶等。

2基因工程药物

2.1抗生素类传统的抗生素类药物是通过微生物发酵或化学合成手段实现的，其生产效率低，成本较高，不适合大规模生产。利用基因技术可以实现对生产抗生素类药物菌种的基因改造，使生产菌种的活性增强，生产产品的目的性增强、表达水平提高，从而在降低生产水平的前提下大量生产抗生素类药物。例如，我国王以光利用基因工程（基因重组技术）改造了螺旋霉素产生菌，大大提高了丙酰螺旋霉素的产量。

2.2活性多肽类活性多肽类在人体内的含量比较低，但是，其却在人体代谢过程中发挥着重要的调节作用，比如激素等。这些物质同样可以作为医学药物来治疗有关物质失衡（过多或过少）所造成的各类疾病。这类物质通常产于各类动物的脏器，成本较高，生产也比较复杂，无法大批量生产。但是，基因工程的诞生为其实施提供了一定的可能性，通过基因重组技术可以使某些微生物产生特定的活性多肽类物质。例如，可以将胰岛基因导入大肠杆菌中，由大肠杆菌生产胰岛素；也可以将生长基因导入酵母菌中，量化生产生长基因，将生长素用于临床治疗。

除了上述两种基因工程药物之外，还有细胞免疫调节因子、疫苗和基因治疗产品等多种基因工程药物。这些药物都极大地弥补了制药领域的不足，给人们的健康带来了巨大的帮助。

3结束语

综上所述，基因工程在生物制药领域发挥着至关重要的作用。它不仅可以为临床疾病的治疗提供大批量的生物药物，还可以有效地诊断和预防当下一些棘手的疾病，比如艾滋病、遗传病和癌症等。因此，为了促进我国生物制药领域的进一步发展，有关方面的研究人员要不断学习基因工程方面的知识，并要将其切实应用到生物制药中。

篇7：基因工程制药的研究论文

基因工程制药是随着DNA重组技术的发展而发展的。基因工程技术(Geneticengineering)是现代生物技术的核心,其快速发展,使得融入了包括医学、生物学、化学和物理学等多学科最新研究成果的生物制药也已成为近些年来发展虽快的高新技术产业之一。不断研制成功并投放市场的生物技术药品和诊断试剂在为人们诊病、治病的同时,更给人们带来了攻克和治愈各种疑难疾病的希望。基因工程制药已经成为利用现代生物技术生产的最重要的产品,并成为衡量一个国家现代生物技术发展水平的一个最重要的标志,生物制药已成为制药业中发展最快和技术含量最高的领域[1]。从1982年第一个新生物技术药物基因重组人胰岛素上市至今,生物制药产业只有20余年历史,约有100余种产品,但这些产品在治疗肾性贫血、白细胞减少、癌症、器官移植排斥、类风湿关节炎、糖尿病、矮小症、心肌梗死、乙肝、丙肝、多发性硬皮病、不孕症、粘多糖病、法布莱氏病、囊性纤维化、血友病、银屑病和脓毒症等,在很多领域特别是疑难病症上,起到了传统化学药物难以达到的作用。本文简要介绍以基因工程蛋白质药物为主的基因工程制药的概况。

1基因工程产业化过程中存在的问题

1.1重复投资，缺乏创新90年代以来涉及基因工程药物的企业大量涌起，但大多是仿制，很少拥有独立知识产权的药品。基因工程制药企业往往是多家生产一种产品，造成不良竞争，企业也得不到合理的利润，故对产品的研发投入更不上，很难进入良性发展轨道。

1.2开发能力落后我国在生物技术“上游”已与国外差距缩小，但“下游”技术仍有很大差距，如工艺设备、分析仪器主要依赖进口。又如高产率的分离纯化处理工艺，蛋白产品的稳定性及制剂的配方，高质量的控制鉴别和测试，执行GMP的操作规范等方法，都与国际水平存在差距。

1.3融资困难，资金不足基因工程制药产业是高科技产业，具有高投入，高风险的特点，目前其资金的主要来源还是银行贷款。这种单一的融资渠道，使的企业资金不足，很难拥有竞争力。

2增强生物基因制药产业价值的发展思路

通过上述分析，我们可以了解到，生物基因制药产业的产业链发展不完善，产业化水平较低。基于网络效应与互补性理论对生物基因制药产业的分析，本文提出以下增强生物基因制药产业价值的发展思路。

2.1加快技术创新与技术互补提高产业化水平由于一种生物基因药物的从研发到上市一般情况下需要5-的时间，而药品的专利期为，在基因药物的研发期间，需要投入大量的成本，而且成功率较小，风险较大，因此制药公司都努力使企业的研发成本降到最低，为了达到这种效果，制药公司可以和学校进行产学研结合，技术互补，联合协作，形成战略联盟，加快药物的开发进程，使药物尽快上市，实现产品价值。

2.2采取多种互补营销形式，做大企业规模目前生物基因制药企业大部分为中小型企业，生产规模和经济效益无法与国内外大公司抗衡，面对这种现状，要采取一定措施，进行优势资源互补，扶持现有优势企业做大做强。采取市场互补性营销方案，通过重点医药企业相互合作，实现市场的发展和繁荣。加大吸引外资力度，与国际跨国公司进行战略联盟，依靠其雄厚的资金和先进的管理经验，提升研发技术水平，提高产品质量和竞争力[2]。利用资源互补，加大对医药工业园的支持力度，吸引产业链中各环节强势企业进驻医药产业，调整生物基因制药产业结构，发挥医药工业园的聚集作用和集群效应，加速基因制药产业链的孵化与构建，以增强生物基因制药产业价值创造能力。

2.3加大R&D的投入,建立科研成果快速转化的机制是否具有研究、开发能力是衡量医药企业竞争力的重要因素。,药品知识产权保护是我们面临的严峻问题。因此,鼓励技术创新,加大R&D的投入,提高科研开发人员的积极性,建立一支具有较强实力的药物创新、研发队伍显得非常紧迫。在研发方面,应注重与世界各地的高科技人才的合作,借助外脑,进行虚拟研发;在政府的支持与投入下,与科研机构合作,扩大资金、技术实力,集中优势资源,建立多学科参与、多部门合作的创新体系;建立科研成果转化机制,缩短药品开发周期,提高开发效率,形成一种集产、学、研、商和风险投资为一体多赢的`研究与开发局面。美国、德国政府立法规定企业每年R&D投入不能低于年销售额的3%,且用于R&D的费用均免征税收[3]。我国也应颁布类似的法令和优惠政策,强制并鼓励企业创新。

2.4制定人才发展战略,加大人力资源的开发利用力度能否吸收和培养科技人才,推进企业的技术进步和产品升级,是企业保持核心竞争力并立于不败之地的关键。据报道,我国加入WTO后的第一个星期里,国外大型公司在北京中关村就挖走了大量国内企业优秀人才。现代市场的竞争,实质上是人才的竞争[4]。因此,企业必须树立以人为本、人才至上的观念,建立人才激励机制,制定人才发展战略,广招贤才,引进具有国际先进管理经验的人才和系列项目,以提高企业的核心竞争力。

2.5建立风险投资机制国外的大量实践证明,风险投资是解决高技术产品商品化、产业化过程中资金困难的有效途径。当前,我国应营造良好的国际风险投资环境,鼓励风险投资,吸收国外风险投资家进入我国市场,利用风险投资促进基因工程产业化发展,从而建立具有国际竞争力的企业集团。同时,我国应尽快建立适合我国高科技产业发展的融资体制,解决资金瓶颈问题,使我国的高科技产业发展步入快车道。

2.6加大对高新技术企业的优惠政策利用税收、信贷、土地资源等政策性优惠,提高企业的创新能力和规模化生产能力,提高其市场竞争力。加强对国家一类新药的市场保护机制,将国家一类新药自动列入国家基本用药目录,优先考虑国家一类新药的各地招标和进入地方/医保用药目录,为我国创新药品的市场发展提供较好的生存条件,鼓励企业的产品创新。

近两年,我国科技部生物工程中心组织力量对全国400多家单位和几十家生物技术企业做过一次调查,在咨询了300多位海内外专家的基础上,置定了21世纪初的生物技术发展战略。我国采取的措施主要是立足创新、集成应用、需求向导和重点突破的战略[5]。集成应用一方面集成现有成熟技术,另一方面是多学科、多领域的集成。要实现这一宏伟的战略目标,除制定具体对策外,要走官、产、学、研、资相结合的道路。先建小企业,慢慢发展壮大。力争在今后10到之内,我国生物技术产业的整体水平,尤其是基因制药水平能步入世界发达国家行列,而且生物技术产业能够成为国民经济的支柱产业之一。让我们共同努力,刻苦工作,迎接具有中国特色的生物技术产业的新纪元。

篇8：基因工程词汇

腺苷脱氨酶缺乏症 adenosine deaminase deficiency (ada)

腺病毒 adenovirus

alagille综合征 alagille syndrome

等位基因 allele

氨基酸 amino acids

动物模型 animal model

抗体 antibody

凋亡 apoptosis

路-巴综合征 ataxia-telangiectasia

常染色体显性 autosomal dominant

常染色体 autosome

细菌人工染色体 bacterial artificial chromosome (bac)

碱基对 base pair

先天缺陷 birth defect

骨髓移植 bone marrow transplantation

brca1/brca2

癌 cancer

后选基因 candidate gene

癌 carcinoma

cdna文库 cdna library

细胞 cell

染色体 chromosome

克隆 cloning

密码 codon

天生的 congenital

重叠群 contig

囊性纤维化 cystic fibrosis

细胞遗传图 cytogenetic map

缺失 deletion

脱氧核糖核酸 deoxyribonucleic acid (dna)

糖尿病 diabetes mellitus

二倍体 diploid

dna复制 dna replication

dna测序 dna sequencing

显性的 dominant

双螺旋 double helix

复制 duplication

电泳 electrophoresis

ellis - van creveld syndrome

酶 enzyme

外显子 exon

家族性地中海热 familial mediterranean fever

荧光原位杂交 fluorescence in situ hybridization (fish)

脆性x染色体综合征 fragile x syndrome

基因 gene

基因扩增 gene amplification

基因表达 gene expression

基因图谱 gene mapping

基因库 gene pool

基因治疗 gene therapy

基因转移 gene transfer

遗传密码 genetic code (atgc)

遗传咨询 genetic counseling

遗传图 genetic map

遗传标记 genetic marker

遗传病筛查 genetic screening

基因组 genome

基因型 genotype

种系 germ line

单倍体 haploid

haploinsufficiency

造血干细胞 hematopoietic stem cell

血友病 hemophilia

杂合子 heterozygous

高度保守序列 highly conserved sequence

hirschsprung病 hirschsprung's disease

纯合子 homozygous

人工染色体 human artificial chromosome (hac)

人类基因组计划 human genome project

人类免疫缺陷病毒 human immunodeficiency virus (hiv)/

获得性免疫缺陷综合征 acquired immunodeficiency syndrome (aids)

huntington舞蹈病 huntington's disease

杂交 hybridization

免疫治疗 immunotherapy

原位杂交 in situ hybridization

继承的 inherited

插入 insertion

知识产权 intellectual property rights

敲除 knockout

白血病 leukemia

库 library

键、连接 linkage

部位、场所 locus

优势对数评分 lod score

淋巴细胞 lymphocyte

畸形 malformation

描图 mapping

标记 marker

黑色素瘤 melanoma

孟德尔 mendel, johann (gregor)

孟德尔遗传 mendelian inheritance

信使rna messenger rna (mrna)

[分裂]中期 metaphase

微阵技术 microarray technology

线立体dna mitochondrial dna

单体性 monosomy

小鼠模型 mouse model

多发性内分泌瘤病 multiple endocrine neoplasia, type 1 (men1)

突变 mutation

神经纤维瘤病 neurofibromatosis

尼曼-皮克病 niemann-pick disease, type c (npc)

non-directiveness

rna印记 northern blot

核苷酸 nucleotide

神经核 nucleus

寡核苷酸 oligo

癌基因 oncogene

parkinson病 parkinson's disease

专利权 patent

血系/谱系 pedigree

表型 phenotype

物理图谱 physical map

多指畸形/多趾畸形 polydactyly

聚合酶链反应 polymerase chain reaction (pcr)

多态性 polymorphism

定位克隆 positional cloning

原发性免疫缺陷 primary immunodeficiency

引物 primer

原核 pronucleus

前列腺癌 prostate cancer

蛋白 protein

隐性 recessive

逆转录病毒 retrovirus

核糖核酸 ribonucleic acid (rna)

核糖体 ribosome

risk communication

序列标记位点 sequence-tagged site (sts)

联合免疫缺陷 severe combined immunodeficiency (scid)

性染色体 sex chromosome

伴性的 sex-linked

体细胞 somatic cells

dna印记 southern blot

光谱核型 spectral karyotype (sky)

替代 substitution

自杀基因 suicide gene

综合征 syndrome

技术转让 technology transfer

转基因的 transgenic

易位 translocation

三体型 trisomy

肿瘤抑制基因 tumor suppressor gene

载体 vector

蛋白质印记 western blot

wolfram综合征 wolfram syndrome

酵母人工染色体 yeast artificial chromosome (yac)

篇9：基因工程实验课程教学优化探析论文

基因工程实验课程教学优化探析论文

摘要：基因工程实验课是动物生物技术、动物医学等专业学生必修的基础课，对相关专业的专业课学习具有重要的指导意义。在该课程的教学实践中，笔者通过对实验教学设备更新、实验教学理念转变、实验考核方法改革、师资队伍强化、教学与科研实验、毕业设计相结合等手段，丰富了基因工程实验课的教学形式。实行课程改革后，全面提升了学生对基因工程实验技术的认识程度，增加了学生的学习兴趣，培养了学生实验设计、分析及解决问题的能力，为学生毕业设计和申请大学生开放性、创新性实验提供了良好的实验技术保障。

关键词：基因工程；实验技术；教学；改革；仪器管理；考核体系；教学效果；实践

基因工程（genetic engineering）也称遗传工程，是现代生物技术的核心技术，也是理论与技术并进的新兴学科。基因工程又称基因拼接技术或DNA重组技术，是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的复杂操作。它是生物工程的一个重要分支，与酶工程、细胞工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。

我国教学改革研究的着眼点和重要任务是在实验课的教学中进一步吸引学生主动学习，激发学生独立思考的兴趣，培养创新意识[1].传统的实验教学方法存在知识结构老化、课堂教学内容更新较少以及学生学习被动等问题，已不能满足培养学生综合素质能力的要求；因此，有必要针对这些不足进行改革，推动基因工程实验技术的实验教学质量的提高。笔者充分利用了教育部高校设备建设专项资金的投入，进行仪器设备的更新，同时改革实验教学内容、完善考核体系、加强师资队伍的培训、基因工程实验技术教学与科研实践及毕业设计相结合等措施，充分调动了学生的学习热情，培养了学生的创新能力和分析问题及解决问题的能力。

1更新仪器设备配置，强化仪器管理水平

基因工程实验是本校动物生物技术、动物科学、实验动物及动物医学专业必修的基础课，为了使基因工程实验更好地顺利开展，达到培养学生实验技能的目的，加强实验室建设，加大实验资金投入是极其必要的。为此，在学校和学院领导的大力支持下，利用教育部高校设备建设专项资金和学校实验建设经费，购置了ABI实时定量PCR、BIO - RAD凝胶成像系统、Tiangen DNA定量仪、博日PCR仪、DYCP - 35型电泳仪、Finnpipette移液器、Biofuge型低温高速离心机、SW - CJ - 1A型超净工作台、DYCP - 31型水平电泳槽、HSZ - Q型恒温振荡器等仪器设备，为实验的顺利开展提供了必要的硬件保障。

鉴于仪器设备价格昂贵，操作复杂，实验开始前制订了仪器简明操作手册，组织学生进行观摩学习，重点讲解仪器原理、相关理论知识、操作方法、注意事项、仪器维护与保养等，并利用提前准备好的样品进行仪器模拟操作演示，使学生充分掌握仪器的操作方法；同时指定实验组长做好仪器使用记录的登记，确保仪器的正常运转。

2打好实验基础，树立“先入为主”的理念

大学生的特点是好奇心很强，思维活跃，甚至是“异想天开”,但基本实验技能训练相对欠缺[2].而基因工程实验具有取样操作严格、试剂需要量少、各组分加入量要精确等特点；因此，在开展实验之前需要对学生进行基本技能的培训，包括如何选取组织样品、移液器的正确使用方法、实验试剂的配制及实验材料的高压灭菌、试剂的正确加入方法和顺序、样品的振荡方法及混匀程度等。通过反复训练，使学生更好地掌握药品的性能与用途、操作注意事项，也锻炼了学生分析问题、解决问题的能力，确保学生在后续的正式实验中，能够准确无误地开展相关的实验内容。

3优化实验教学内容，完善实验考核体系

3. 1实验教材的编写

目前，在售的基因工程实验指导用书很多，但真正适合本科生基因工程实验的却很少。大部分存在实验内容过多，可操作性不强，实验内容过于陈旧，相对于先进的基因工程理论存在滞后现象，无法满足培养学生现代化生物学实验技能的需求；因此，编写一本切实可行的实验教材是极为重要的。为此，学院组织经验丰富的教授、讲师及相关实验技术人员，紧贴科学发展前沿，结合学院教学、科研实际，共同编写了《基因工程实验技术》指导用书，并由吉林大学出版社公开出版发行。新的实验教材，将基因工程新理论、新技术、新方法引入到具体的实验中，加大了设计性、综合性实验的比例，体现了学院的专业特点及办学特色，是一本内容丰富、适合本科实验教学的优秀教材，得到了学生们的一致认可。

3. 2改革教学内容，突出专业特色

基因工程是建立在遗传学、微生物学、生物化学、细胞生物学及分子生物学的基本原理和知识的基础之上的应用性科学。开设基因工程实验要求学生有扎实的上述课程实验基础。通过对基因工程实验的学习，使本科生熟练掌握DNA重组的方法，并能进行自主设计实验，完成对特定基因进行克隆及分析。由于实验具有连续性、周期长的特点，笔者采取实习周的方式授课，计划学时数为48学时。具体实验内容见表1.

学生通过学习基因工程实验各环节相关的理论知识及实验方法，掌握了常用DNA操作及基因重组技术方法，而且对基因工程原理有更深入的'理解，提高了科学研究和实验操作能力。

3. 3健全考核体系，提高教学效果

客观、有效、真实、公正的实验考核体系不仅能提高学生对实验的重视程度，也能增强学生探索知识的积极性，调动学生的学习热情和主人翁意识，从而大大提高实验教学的效果，达到培养新世纪生物学人才的目的。为此，本课程的考核采取多元化评价模式，考核内容主要包括以下三部分。

3. 3. 1平时成绩考核（共45%）包括实验态度（10%）、实验室常识（5%）、实验技能的掌握（10%）和实验报告（20%）等方面。实验态度（10分） ,主要考察学生的出勤情况、预习情况、对实验课的重视程度、对实验室仪器设备的爱护及与其他人合作等。采取扣分制，例如无故迟到一次扣3分；无故旷课一次扣10分；扣分超过10分后从其他项目的分值里扣除。学期中安排一次实验室常识考试，考试的分值为5分。实验技能的掌握（10分） ,主要考察学生对基本实验技能的理解和掌握，采取扣分制。实验报告由教师根据学生上交的实验报告的规范性、分析及讨论的合理性等进行打分，累计20分。

3. 3. 2学生的独立实验设计和实践过程考核（25%）注重学生的创新性思维和独立分析、解决问题等能力的提高。包括：设计思想、方案及设计报告（10%） ; 实验操作能力（5%） ,考察学生对自己设计的实验具体实施能力；实验结果、分析报告（10%） ,考察学生在实验实施过程中对出现的问题进行分析和解决的能力，是否能达到预期结果及结果的分析报告。

3. 3. 3考试（30%）对实验室常识、实验设计、实验方法、实验原理等进行考试。

4加强师资队伍建设与培养，提高教师业务素质

实验教师的结构组成和业务水平直接影响到实验课的实施及效果。近年来，分子生物学的飞速发展，赋予了基因工程理论与实践更多的内涵，这就要求实验教师有丰富的理论知识和操作技能。实验教师除了掌握分子生物学常用的实验技术，如：PCR技术、RT - PCR技术、基因克隆与表达技术、文库构建、实时定量PCR技术等，还应积极参与科研工作，申请国家级及省级课题，在科研中不断学习，充实自己的知识结构，了解本学科领域的发展前沿、新技术、新方法，提高实验教学能力，从而更好地完成教书育人的使命。同时，积极发挥实验室资源和师资特长，鼓励实验技术人员和优秀的硕/博士人员参与到实验教学中，充分发挥年轻人的传帮带作用[3],调动学生学习的兴趣和主动性，提高实验教学的质量和水平。

5实验教学与科研、毕业设计相结合

积极将教师成熟的科研成果转化到实验中去[4 - 5],促进实验教学内容改革，保证实验内容的新颖性、前沿性，也能增强学生的创新意识及思维。同时，以教师的科研课题为依托，开设第二实践课堂，向学生展示科研项目研究的过程，包括课题整体思想、实验方案的设计、项目实施、数据处理与分析、问题解决、结果讨论等，为开设吉林大学大学生开放性、创新性实验打下良好的基础。学生在完成课堂内基因工程实验和课堂外相关的创新性、开放性实验的同时，已能掌握一整套比较完整的基因工程实验技术，加深了对理论知识的系统了解，从而为毕业论文的设计、实验实施、论文撰写及答辩等奠定了坚实的基础。

6小结

通过对实验室硬件更新、实验内容及考核方法改革、强化师资队伍建设等手段，基因工程实验课取得了明显的教学效果，全面提升了学生对基因工程实验技术的认识程度，激发了学生的学习兴趣，培养了学生实验设计、独立思考、协作互助、分析问题及解决问题的能力，树立了正确的科研态度，提高了学生的综合素质，基因工程实验教学改革得到了学生们的一致好评。

参考文献：

[1] 李开智，肖胜军，郭芳，等。病理学创新性实验教学初探[J].山西医科大学学报：基础医学教育版，,9（4） :416 - 418.

[2] 曹锦艳，李莉，任林柱，等。基因工程实验创新性教学实践与探索[J].科技创新导报，（19） :186.

[3] 刘幸福，吴元喜，余龙江，等。论生化实验教学改革中“小老师”自身的能力培养[J].实验技术与管理，,22（2） :102 - 105.

[4] 韦化，曾冬梅，秦钢年。实验教学与科研相结合，培养学生的创新能力[J].实验技术与管理，,25（5） :31 - 34.

[5] 廖庆敏，秦刚年，李勉媛。科研融入实验教学提高学生创新能力与综合素质[J].实验室研究与探索，,28（3） :15 - 18.

篇10：浅谈基因工程在番茄抗旱方面的作用论文

浅谈基因工程在番茄抗旱方面的作用论文

摘要：番茄抗旱性是由许多微效基因座和数百个影响干旱形态和生理反应的基因控制的, 阐明番茄抗旱的分子机制、开发分子标记辅助选择将有助于加速培育具有抗旱性的番茄新品种。本文概述了番茄抗旱分子机制的研究进展、番茄在干旱条件下的形态特征变化和抗旱育种, 重点阐述了番茄抗旱性基因工程改良方面的研究进展, 为进一步应用现代生物技术进行植物抗旱性基因工程改良和分子标记辅助选择育种提供方法和思路。

关键词：番茄; 抗旱; 育种; 基因工程; 综述;

中国人口众多, 农业生产所用的淡水资源十分匮乏, 人均仅有2 200 m3, 是全球人均淡水资源最贫乏的国家之一 (王海波, 2011) 。干旱缺水在众多非生物胁迫中是最具破坏性的, 同时也是限制作物产量和品质的一个重要影响因素 (Tuberosa&Salvi, ) 。其中生殖生长期受干旱影响最大, 在生殖阶段干旱胁迫可以直接导致作物的产量损失大于50% (Boyer, 1982) 。

干旱胁迫通常伴随着热胁迫或其他胁迫, 植物使用多种策略来响应干旱胁迫并且通过多种信号级联和渗透调节等形态和生理改变以适应干旱。Levitt (1981) 认为, 植物适应干旱的机理可分为避旱、御旱和耐旱, 并且将御旱性和耐旱性统称为抗旱性。避旱即植物在干旱来临之前加速发芽, 缩短生命周期以避免干旱胁迫;御旱即植物在干旱初期, 胁迫尚不严重时, 通过改变地上部和根系性状以减少水分损失, 维持较高的水势, 以应对干旱胁迫;耐旱即植物演变出一系列的缓解机制如积累渗透保护剂, 防止细胞内水分散失;产生胁迫感应信号, 抗氧化剂和活性氧 (ROS) 清除剂;降低光合酶活性以降低光合作用等生理生化反应, 在严重干旱胁迫下维持细胞结构的稳定性。尽管已经有一些策略能够提高植物的抗旱性, 但由于抗旱性状的生理和遗传复杂性, 在改善抗旱性或开发抗旱品种方面进展缓慢。

番茄 (Solanum lycopersicum L.) 是全世界栽培最广泛的蔬菜作物之一, 全球番茄产量达到1.6亿t, 其中超过30%产自中国 (联合国粮农组织,同时, 番茄也是植物科学研究的重要模式植物之一。番茄原产地在南美洲热带地区, 属于需水量较多的一种蔬菜作物, 环境胁迫中干旱胁迫是限制番茄产量和品质的主要制约因素 (柏成寿和陆帼一, 1991) 。因此选育抗旱性强的番茄品种是重要的育种目标。目前, 主要通过常规育种、生物技术或两者结合的方法改良植物的抗旱性。近年来, 诸多学者围绕着番茄抗旱性做了大量颇具价值的研究工作, 为番茄抗旱性的改良奠定了基础。

1 干旱对番茄形态特征的影响

1.1 干旱对番茄根系的影响

根系发育直接受环境因素的影响, 拥有一个健壮的根系对于提高作物的抗旱性非常重要。最具代表性的智利番茄 (S.chilense) 生长在世界上最干旱的地区, 其发达的根系能够促进植株吸收深层土壤的水分 (Chetelat et al., 2009) 。Champoux等 (1995) 认为, 水稻根系厚度、根系表面积、每分蘖根干质量、最大根深度和根/茎比均与田间抗旱性呈正相关。杨再强等发现, 在干旱胁迫时土壤中番茄的浅层根系会减少, 根系深扎、根表面积增加, 然而随着干旱胁迫的加剧, 植物正常的生长机制遭到破坏, 导致根长、根表面积和根尖数等降低, 根系的正常生长受到显着抑制。

1.2 干旱对番茄叶片的影响

水分胁迫或其他逆境信号会诱导多种离子进出保卫细胞, 造成保卫细胞内成分发生变化, 从而导致保卫细胞形态改变, 造成气孔关闭、卷叶、植物的蒸腾速率降低, 与植物抗旱性有关的叶片性状包括叶片形状 (卷叶) 、角质层、气孔密度、气孔孔径、叶片渗透调节等。

Kadioglua等 () 发现, 水稻、玉米、小麦和高粱等作物的叶片适度卷曲可以改变植物叶片结构, 增强光合作用, 通过减少水分蒸发流失延迟衰老并增加冠层光透射。当干旱胁迫严重时, 通过诱导并加速植物叶片的衰老来减少绿叶面积, 从而减少蒸腾和水分的消耗 (安玉艳和梁宗锁, 2012) 。但是在作物生产中, 干旱胁迫引起的叶片衰老, 导致干旱解除后作物冠层面积的减少和光合同化能力的降低, 进而引起整株早衰并最终导致作物产量和品质的下降 (Rivero et al., 2007) 。

气孔在控制植物蒸腾失水、降低叶片表面的高温、吸收CO2进行光合作用以及促进植物生长方面扮演着极其重要的角色 (Damour et al., ) 。番茄气孔大部分集中于叶片下表皮, 叶片下表皮的气孔密度远远大于上表皮;随着土壤水分亏缺强度的增加, 叶片上表皮气孔密度逐渐增大, 而下表皮气孔密度呈现先减小后增大的趋势 (刘朝霞, 2016) 。潘那利番茄 (S.pennellii) 叶片表皮具有较多气孔, 可吸收和利用空气中的水分, 并且叶片上有丰富的蜡质, 可以降低干旱情况下的水分丧失, 对干旱胁迫具有明显的耐受性 (Chetelat et al., 2009) 。

2 番茄抗旱性育种的研究进展

种质资源是育种的基础。由于番茄是一种严格的自花授粉植物, 经过长期的驯化和选育, 番茄的遗传背景逐渐变窄 (Rick, 1986) 。因此, 通过广泛的育种策略丰富番茄的种质资源对番茄育种极其重要。研究人员正努力通过常规育种技术、分子辅助育种和转基因技术等育种方法获得抗旱性强的番茄品种。

2.1 番茄抗旱性基因工程改良研究进展

转基因技术能够打破物种界限、克服生殖障碍, 把重要的抗旱基因整合到品种中, 能够快速、有效地改良作物的抗旱性。植物为了适应干旱胁迫, 进化出多个调节不同干旱响应基因的互作信号传递链, 这些干旱响应基因用于产生在干旱条件下起作用以增强植物抗性的蛋白质, 如转录因子 (TF) 、酶、分子伴侣和其他功能性蛋白等。目前, 已经有很多基因通过超量或抑制表达来检测基因在植物抗旱中的作用, 并且取得了很大的进展, 这些在抗旱中有功能的基因不但可以直接改良植物的抗旱性, 也可以开发标记, 为分子标记辅助选择 (MAS) 育种奠定基础。

2.1.1 抗旱相关转录因子

植物碱性亮氨酸拉链蛋白 (b ZIP) 、干旱响应元件结合蛋白 (DREB) 、NAC和锌指 (Zinc finger) 蛋白等编码多种TF家族成员, 能够提高植物抗旱性 (Yamaguchi-Shinozaki&Shinozaki, 2006;Ariel et al., 2007;Ciftci-Yilmaz&Mittler, 2008;Fang et al., 2008) , 这些TF基因的异位表达或抑制可能激活多种胁迫耐旱机制。

植物的b ZIP转录因子能通过参与脱落酸 (ABA) 信号转导途径, 调控植物对干旱胁迫的反应。Orellana等 (2010) 研究Sl AREB1在番茄中的功能作用时, 将Sl AREB1基因在番茄中超量表达, 转基因番茄植株显着提高了对干旱和高盐胁迫的耐受性, 同时大规模基因表达分析显示Sl AREB1能够上调与高盐、干旱和氧化应激相关基因的表达。

一些DREB/CBF基因在ABA独立的干旱响应过程中起重要作用, 并且通过分离和鉴定该家族的很多成员发现, 它们能够改良植物的抗旱性。首先在拟南芥中发现DREB (包括两个亚类:DREB1和DREB2) 在干旱胁迫中起作用 (Liu et al., ) 。将拟南芥的At CBF1转录因子在rd29A启动子的控制下, 在番茄中异源表达, 能够显着提高转基因番茄植株对干旱胁迫的耐受性, 并且植株正常生长 (Singh et al., 2011) 。然而Li等 (2012) 研究发现, 当SIDREB基因在番茄中超量表达时, 由于合成赤霉素的关键基因下调表达, 导致转基因番茄叶片扩大和节间伸长受到限制, 从而造成矮小的表型, 由此提高了转基因番茄的抗旱性。

NAC由NAM、ATAF和CUC组成, 属于植物特有的TF家族, 番茄中共有102条NAC蛋白, 这个家族的部分基因参与植株对病原体、病毒感染和环境刺激的反应 (Souer et al., ;Nuruzzaman et al., ) 。Liu等 () 研究发现, 将NAC转录因子Sl SRN1沉默能够增加转基因番茄对生物胁迫的敏感性, 如因灰葡萄孢菌、丁香假单胞菌而感染疾病, 但会提高转基因番茄对氧化、高盐、干旱胁迫的耐受性。Sl NAC4调控干旱和高盐的相关基因表达, 在番茄抗旱过程中起着很重要的作用 (Zhu et al., 2014) 。由此, NAC蛋白可以作为功能基因资源, 用于改善植物对生物和非生物胁迫的耐受性 (Nakashima et al., 2012;Puranik et al., 2012) 。

其他转录因子, 如乙烯响应因子 (ERF) 不仅能够促进植物种子萌发、果实成熟、器官脱落、病原体反应和衰老, 还能够参与植物胁迫反应 (Narayana, 1991) ;并且其他研究还证明, ERF的TF家族参与植物胁迫反应 (Lorenzo et al., ) 。Klay等 (2014) 研究发现, 属于番茄ERF家族的转录因子Sl-ERF.B.3基因在干旱以及盐分胁迫下被下调表达, 但有趣的是低温、高温胁迫会诱导其表达。超量表达1个番茄的WRKY转录因子Sl WRKY39, 显着提高了番茄的抗旱能力 (Sun et al., ) 。番茄的1个SR/CAMTA转录因子Sl SR1和Sl SR3L负向调控番茄的抗病能力, 但是正向调控番茄的抗旱性 (Li et al., 2014a) 。

2.1.2 氧化调控相关基因

活性氧 (ROS) 会导致脂质过氧化、蛋白质和核酸的变性等, 可通过抑制ROS积累以减轻干旱胁迫, ROS的清除是由一系列酶和非酶抗氧化剂以及有机化合物完成的 (Gill&Tuteja, 2010) 。

过氧化氢酶 (CAT) 是一种抗氧化酶, 属于ROS清除剂, 负责将H2O2分解成水和氧气, 以维持植株体内活性氧的平衡。将源自大肠杆菌的过氧化氢酶 (cat E) 基因引入番茄的叶绿体后, 转基因株系对过氧化氢具有更高的亲和性, 并且转基因番茄中cat E基因过表达不仅能够提高因冷胁迫或干旱胁迫而引起的氧化损伤的耐受性, 还能够提高由除草剂百草枯引起的氧化应激的耐受性 (Mohamed et al., 2003) 。

在高等植物中, 超氧化物歧化酶 (SOD) 作为抗氧化酶和ROS的清除剂, 负责催化超氧自由基产生的O2和H2O2。在植物细胞中根据酶的活性位点上具有不同的金属 (Fe2+、Mn2+和Cu2+) , 以及它们在亚细胞定位中不同的位置 (细胞质、线粒体、过氧化物酶体和叶绿体) , 将其分为几种SOD异构体 (Wang et al., 2007;Aydin et al., 2014) 。如Mn SOD基因在番茄植株中的`过表达能提高对高盐和干旱胁迫的抗性, 且降低了电解质的渗透率, 这意味着Mn SOD能够降低活性氧对转基因番茄的损伤 (Wang et al., 2007) 。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (G6PDH) 在戊糖磷酸途径中首先氧化葡萄糖-6-磷酸 (G6P) , 是该反应的限速酶, 并且能够产生大量的NADPH。G6PDH活性增强能够为抗氧化系统提供NADPH, 以去除过量的ROS, 保护细胞膜的稳定性 (Santo et al., 2012) 。G6PDH启动子中具有不同的ABA响应元件, 其表达部分是由于ABA的诱导 (Cardi et al., 2011) 。G6PDH在干旱条件下与ABA合成相关的NCED, ABA信号转导因子PP2C, 参与脯氨酸合成的P5CS, 参与ROS清除的抗坏血酸过氧化物酶 (APX) 等其他干旱相关基因均在番茄的应激反应中呈现显着上调和活性增强, 并且在干旱条件下呈现持续增长的状态 (Landi et al., 2016) 。综上所述, 干旱诱导ABA合成和信号传导, 特异性激活ABA应答基因, G6PDH则被特异地诱导, 以此满足清除系统 (例如APX) 增加引起的增加还原剂的需求, 从而调节和稳定ROS的增量, 进而提高了植物的抗旱性 (Landi et al., 2016) 。

2.1.3 信号传导相关基因

当细胞壁首先感知非生物胁迫后会激活涉及不同胁迫基因的信号转导 (Oliveira et al., 2014) 。转录后蛋白修饰如蛋白磷酸化/去磷酸化, 蛋白降解/修饰和第二信使的感应如Ca2+, 它们在胁迫信号传导和调节中发挥重要作用。一些TF和干旱响应蛋白需要通过被磷酸化/去磷酸化或修饰等翻译后调节以获得活性, 例如编码丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 、编码CIPK蛋白激酶的基因、编码钙依赖蛋白激酶 (CDPK或CPK) 和编码蔗糖非酵解型蛋白激酶钙依赖蛋白激酶 (Sn RK) 等的基因都在干旱胁迫信号传导和调节途径中起作用。MAPK在耐受胁迫相关的信号网络中起关键作用 (Huang et al., 2012) 。将植物暴露于各种非生物胁迫条件下时, MAPK参与ABA的调节过程 (Hirayama&Shinozaki, 2007) , Li等 (2013) 使用VIGS方法发现Sp MPK1、Sp MPK2和Sp MPK3基因通过影响ABA-H2O2途径影响H2O2的产生和气孔的运动来增强番茄的耐旱性。超表达Sl MPK7的转基因番茄会积累较少的ROS、更多的脯氨酸和可溶性糖以及诱导胁迫响应基因表达, 提高转基因番茄对非生物胁迫的耐受性 (Yu et al., 2016) 。CIPK和CDPK是两种类型的Ca2+-敏感蛋白激酶, 据报道Md SOS2L1 (源自苹果的CIPK激酶) 能够增加番茄和苹果中抗氧化代谢物的水平(Hu et al., 2016) 。Sn RK是广泛存在于植物中的一类Ser/Thr类蛋白激酶, 在植物抗逆生理过程中具有重要的作用, 例如在番茄中抑制表达Sl Sn RK2.1、Sl Sn RK2.2显着提高了转基因番茄对渗透胁迫的耐受性以及对氧化胁迫的耐受性, 番茄的耐盐性和耐旱性明显增强 (Yang et al., 2015) 。

2.2 番茄抗旱性常规育种的研究进展

番茄抗旱性的常规育种主要采用大规模回交策略获得集亲本优良性状于一体的新品种, 获得超越亲本的杂交后代或者由基因互作产生亲本不具备的新性状类型, 开发具有改良抗旱性和具有高产潜力的新品种 (Slabbert et al., ) 。许多研究表明, 野生番茄及其近缘野生种中含有丰富的耐旱基因, 将这些携带优良耐旱基因的野生番茄与普通栽培种番茄杂交, 可以将双亲的优良性状整合到一起, 从而育成耐旱性强的番茄材料或新品种。例如耐旱野生番茄S.pennellii和普通栽培种番茄S.lycopersicum cv.M82进行杂交, 杂交后代与M82进行回交, 在干旱条件下后代的产量显着高于亲本 (Gur&Zamir, 2004) 。

由于常规育种是通过植株的表型性状来推测抗旱性的基因型, 而抗旱性是由多个小的微效基因座控制, 且遗传多样性, 遗传力低, 抗旱性相关性状的基因型-环境相互作用水平较高, 所以番茄抗旱育种中常规育种的进展仍然相当缓慢。随着现代生物技术的迅速发展, 人们开始利用分子生物学手段进行植物抗旱性分子改良研究。在利用基因工程改良番茄抗旱性的同时, 分子标记辅助选择 (MAS) 技术也应用到改良作物抗旱育种实践中。采用MAS技术能够追踪调控抗旱性状的遗传位点, 免去多年的大量田间测试工作, 提高选择效率, 同时高分辨率的遗传图谱和物理图谱建成之后, 就可以通过图位克隆技术分离抗旱相关基因, 研究抗旱基因的功能。同样, 标记辅助回交 (MABC) 的策略可以将抗旱供体基因型的主要数量性状基因座 (QTL) 渗入高产但不抗旱或干旱敏感的受体亲本中, 以提高植物的抗旱性。

3 展望

番茄营养丰富, 风味独特, 深受人们的喜爱。近年来我国番茄栽培面积不断增加, 尤其是设施栽培。但是农业水资源匮乏是限制番茄生产的重要因素之一, 因此, 科学合理地进行番茄生产是众多研究人员的目标。

在自然条件下, 干旱胁迫的时节、强度和持续时间是高度动态和不可预测的, 这使得抗旱性研究复杂化。因此, 如果条件允许, 在评估抗旱时应与其他主要的非生物胁迫如高温和高盐联系起来, 因为干旱胁迫经常伴随高温胁迫的发生, 并且植物在响应这些胁迫时会在多种水平上发生交互作用。

通过转基因的方法已经分离和鉴定了许多与作物抗旱性相关的基因。然而, 检测这些基因对番茄抗旱性的影响主要在温室、小盆中或仅在幼苗期间进行, 只有少数在田间检测。由于田间干旱胁迫的复杂性, 那些温室中对改良抗旱性有效的基因在用于育种程序之前必须在田间进行进一步评估。并且一些基因对作物正常生长或增产潜力会有负面影响, 例如植物在遭遇不利的环境时, 植株变得矮小, 减少能量或水分的流失以适应逆境。所以在番茄抗旱育种过程中, 在明确基因功能的基础上, 还需要建立科学的抗旱评价体系。目前, 利用现代分子生物学和MAS结合的方法进行育种, 是提高番茄抗旱性的有效途径。

基因组编辑也是一种精准、高效的基因工程方法。其中CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein) 系统只需合成1个sg RNA就能实现对基因的特异性修饰, 操作简单。利用此系统将番茄的Sl MAPK3基因进行定点敲除, 番茄表现对干旱高度敏感 (Wang et al., ) 。尽管关于基因编辑技术在番茄抗旱性方面的报道并不多, 但番茄具有高效的转化方法、二倍体基因组、高质量的基因组序列以及极高的经济价值, 在众多双子叶植物中是CRISPR/Cas9基因编辑技术的理想候选者 (Brooks et al., 2014) , 并且基因编辑技术能够定向修饰基因, 能够获得不含转基因痕迹的后代, 操作方便。因此基因编辑技术在改良番茄性状、提高抗旱性方面极具潜力。

参考文献

[1]安玉艳, 梁宗锁.2012.植物应对干旱胁迫的阶段性策略.应用生态学报, 23 (10) :2907-2915.

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[3]刘朝霞.2016.土壤干旱胁迫对番茄根系生长、气孔特性及保护酶活性的影响[硕士论文].南京:南京信息工程大学.

[4]王海波.2011.海水淡化用p H及电导率在线检测系统研究[硕士论文].杭州:杭州电子科技大学.

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篇11：基因工程及其应用教案

基因工程及其应用教案

【教学目标】知识目标：1、简述基因工程的基本原理 2、理解基因工程中所需要的工具 3、了解基因工程的基本步骤能力目标：通过简单的模型制作，理解基因工程中工具的使用，以及基因工程的方法。情感目标：通过对基因工程工具与基本步骤的了解，引导学生感受科学家在分子水平上操作的.精确性与难度。【教学重难点】基因工程的基本原理及工具【课题导入】图片展示基因工程的几个成果，并结合生活中听说过的一些实例，说明其实基因工程的某些成果就在我们身边。那么什么是基因工程？一、基因工程的概念阅读课本，找出基因工程的概念，并从中找出三个关键点：基因工程作用的对象（DNA分子）、场所（细胞外改造、细胞内表达）及结果（定向改造生物性状）。采用类比的方法，引导学生认识到在基因工程中是需要一些工具的。二、基因工程的工具 1、基因的剪刀――限制性核酸内切酶特点：专一性（只识别特定的核苷酸序列，并在特定位点切割）结果：产生粘性末端（说清楚什么是粘性末端） 2、基因的针线――DNA连接酶（强调连接酶连接的是脱氧核糖与磷酸基团之间的化学键）发放卡纸，分组构建重组DNA模型 3、基因的运载体说明运载体的特点及常用的运载体（尤其介绍质粒）三、基因工程的基本步骤引导学生看书、拼图，了解基因工程的基本步骤。【板书设计】 6-2 基因工程及其应用一、概念对象：DNA分子场所：细胞外改造、细胞内表达结果：定向改造性状二、工具剪刀：限制酶产生粘性末端针线：DNA连接酶运载体：质粒、病毒三、基本步骤 1、提取 2、结合 3、导入 4、检测与鉴定

篇12：植物基因工程课件

植物基因工程课件

（1）植物基因转化受体系统的条件

（2）植物基因转化受体系统的类型和特性。

（3）植物基因工程载体的种类和特性

（4）根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能：T-DNA、Vir区操纵子的基因结构与功能。

（5）农杆菌Ti质粒基因转化机理

（6）农杆菌Ti质粒的改造及载体构建

（7）载体构建中常用的选择标记及报告基因

（8）根癌农杆菌的转化程序及操作原理

（9）外源基因在植物中的表达

了解植物基因转化受体系统的类型、特性掌握Ti质粒的结构与功能，植物载体构建原理，植物基因工程常用的载体类型。

重点

根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的原理和方法

难点

植物载体构建原理

关键点

转基因植物的获取和检测

教学目的和要求

教材分析

主要教具和设备材料

投影仪、电脑、常规教学设备板书与多媒体授课相结合

教法思考题

1. 植物基因工程载体种类？

2. 根癌农杆菌转化程序？

心得

在自然界的许多双子叶植物中，常常发生一种严重危害植物生长的病害——冠瘿。已知90多科，600多种双子叶植物都能感染这种病。一般认为单子叶植物和裸子植物对此病不敏感。70年代中期，世界上几个实验室发现诱发肿瘤的根癌农杆菌中含有大量的诱瘤质粒Ti(tumor-inducing plasmid),且证实了肿瘤的形成正是由于pTi中的特定片段——T-DNA转移并稳定地整合进植物细胞核基因组中的结果；由于其上载着的冠瘿碱合成基因和激素合成基因表达，因此分泌冠瘿碱并形成肿瘤。人们就把这种冠瘿的形成过程称作天然的植物细胞转化系统。

农杆菌将自身的DNA插入植物细胞诱发肿瘤只对其本身是有益的，重要原因之一是因为农杆菌诱发植物细胞合成冠瘿碱为自己提供食物。植物自身不能利用这种物质，只能为它的合成付出代价，别的细菌也不能利用它，在自然条件下，只有农杆菌能分泌分解冠瘿碱的酶，将这些特异产物作为唯一的碳源和氮源来利用。

肿瘤的产生是由于T-DNA上的激素合成基因所致，刺激细胞生长而产生肿瘤，这是T-DNA转入的一个副产品。

Ti质粒给自己设计出一套为其自身存活的非常优秀的进化格局：它感染植物细胞，使之出现愈伤组织增生，后者便产生出供带有Ti质粒的细菌用作能源、碳源和氮源的冠瘿碱；而冠瘿碱的产生又可激发Ti质粒转移到原先没有存在这种质粒的土壤农杆菌中去，如此周而复始得到不断发展。

Ti质粒是一类理想的植物基因工程载体，通过它们可以将外源DNA转移到植物细胞，并再生出能够表达外源基因的转基因植物。 Ti质粒还具有若干其他载体所不具备的优点：

（1）T-DNA能够进行高频的转移，而且这种转移的DNA通常是以未发生变化的完整形式整合到植物的核基因组上。

（2）Ti质粒不存在包装限制问题，大到50kb的外源DNA也能顺利地包装与转移。

一、植物基因工程载体种类

据载体的功能和构建过程，可把有关载体分为四大类型（九种载体）。克隆载体、中间载体、卸甲载体、转化载体

据载体的功能和构建过程，可把有关载体分为四大类型，九种载体。

1、克隆载体（目的基因的克隆载体）

通常由多拷贝的E.coli小质粒为载体功能：保存和克隆目的基因。

2、中间载体又分为中间克隆载体和中间表达载体。

中间克隆载体：由大肠杆菌质粒插入T-DN段及目的基因、标记基因等构建而成。

功能：构建中间表达载体的基础。

分为：中间粘粒载体、质粒粘粒愈合载体、基因标记载体。中间表达载体：含有植物特异启动子的中间载体

功能：作为构建转化载体的质粒。

3、卸甲载体

解除武装的Ti质粒或Ri质粒。（onc+ -------- onc-）功能：作为转化载体的受体质粒

4、转化载体

最后用于目的基因导入植物细胞的载体，亦称工程载体。它是由中间表达载体和卸甲载体构建而成。

分为一元载体系统（顺式载体）和双元转化载体系统（反式载体）。一元载体系统包括共整合载体和拼接末端载体（SEV）。

二、根癌农杆菌Ti质粒

1、Ti质粒的类型、结构与功能

（1）类型

Ti质粒是根癌农杆菌染色体以外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，分子量为95~156 x 106D，约150 ~ 200 Kb长。根据其诱导的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可分为三类：章鱼碱型（octopine）：pTiAch5, pTiA6NC, pTiB653, pTiAg162 胭脂碱型（nopaline）：pTiT37, pTiT38, pTiC58

农杆碱型（agropine）和农杆碱素型（agrocinopine）或琥珀碱型（succinamopine）

（2）结构和功能

各种Ti质粒都可分为四个区：

①T-DNA区（transferred-DNA regions）：是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA。该DN段上的基因与肿瘤的形成有关。

②Vir区（Virulence region）：该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区与vir区在质粒上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的1/3。

③Con区（region of replication）：质粒结合转移位点编码区，该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此，称之为接合转移编码区。

④Ori区（origin of replication）：该区段基因调控Ti质粒的自我复制，称之为复制起始区。

3种成分与Ti质粒肿瘤诱导有关:

T-DNA：它可转移至宿主细胞，是一种可移动因子。

毒性区：vir基因可产生转移活动蛋白，对增强植物细胞的转化是必须的。土壤农癌杆菌染色体基因:间接参与转化，负责将细菌细胞接合于植物上。

2、T-DNA的基因结构和功能

（1）T-DNA的结构特点长约23Kb

在T-DNA的5’和3’端都有真核表达信号，如TATAbox，AATAAbox及polyA等。

T-DNA的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序列，分别称之为左边界（BL或TL）和右边界（BR或TR）。该25bp边界序列属保守序列（TGACACGATATAT TGGCGGGTAAAC）。通常右边界序列更为保守，左边界在某些情况下有所变化。左边界的缺失突变仍能致瘤，但右边界缺失则不致瘤，这时几乎完全没有T-DNA的转移，这说明右边界在T-DNA的转移中的重要性。

胭脂碱型肿瘤，为一连续的一段序列，长约23.4Kb，有肿瘤系，仅一个拷贝，有的T-DNA是多拷贝的。

章鱼碱型肿瘤：T-DNA分左右两部分（TL-DNA和TR-DNA），各自带有左右边界序列。左区的顺序变化不大，长度约13Kb，通常一个拷贝，但也有几个拷贝首尾相连排列。含章鱼碱合成酶基因和致瘤基因。TR-DNA较短，长约6-7Kb，拷贝数达数个或数十个，有的肿瘤系中没有TR-DNA。TR-DNA编码5个基因，如甘露碱和冠瘿碱合成酶基因。

（2）T-DNA上的编码基因及功能

章鱼碱型和胭脂碱型T-DNA的转录有下述共同特点： T-DNA的两条链都是有意义链；

T-DNA上每个基因都有各自的启动子；基因的转录由植物细胞RNA聚合酶II完成；

T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和终止的调节信号，在其5’端转录起始处有TATA和CAAT盒。另外，至少在5个T-DNA基因中发现有一个8bp的相同顺序（TTTCAA GA），同时AATAAA加尾信号也在同一条链上发现。

植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。 3、Vir区操纵子的基因结构与功能

毒性区的大多数基因产物都控制T-DNA的转移，这个区域的突变往往导致农杆菌感染植物能力的下降。

（1）Vir区操纵子的基因结构

章鱼碱型Ti质粒：Vir区大小为40kb，含有VirA、B、C、D、E、F、G、H（PinF）等8个操纵子，共24个基因。大多数操纵子含有多个基因VirA（1）、VirB（11）、VirC（2）、VirD（4）VirE（2）、VirF（1）、VirH（2）。

胭脂碱型Ti：有7个操纵子，少一个VirF，它们的第一个操纵子也不同，章鱼碱型Ti是VirH，而胭脂碱型Ti是Tzs，其功能也不同。 Vir区基因的表达有两种方式：

组成型表达；在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水平，virA，virG、virH 诱导型表达：这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物时，在植物受伤组织分泌的信号分子作用下才能启动表达，如virB、C、D、E

virG虽属于组成型表达，但有植物信号分子存在下表达量提高10倍，也具诱导表达特性。

（2）Vir区操纵子的基因的功能

①Vir A 单个基因，2.4kb，仅编码一条多肽。Vir A编码一种结合在膜上的化学受体蛋白（92KD），可直接对植物产生的酚类化合物感应，是一种感应蛋白。

Vir A的活化：当AS与Vir A的受体部分结合后，会使整个Vir A蛋白构象发生变化，其C端活化。Vir A蛋白的胞质区有自激酶的功能，可在保守的组氨酸残基上磷酸化，从而Vir A蛋白被激活。激活后的Vir A具有转移其磷酸基至Vir G蛋白的一个宿存的天冬氨酸残基的能力，使Vir G蛋白激活。

②Vir G Vir G ，只有1Kb，单基因，编码DNA结合蛋白,其C端有DNA结合活性，N端具有磷酸化的酸性结构。

从总体效应讲，Vir G基因是属于组成型表达的，这对于细菌迅速地将外部环境信号传递到细胞内十分有利。

当磷酸化的A蛋白将其磷酸基转到Vir G保守的天冬氨酸残基上时，使Vir G蛋白活化，活化Vir G蛋白可以二体或多体形式结合到Vir启动子的特定区，从而成为其它Vir 基因转录的激活因子，打开Vir B、C、D、E、H等几个基因。Vir A或G突变后会减弱或完全失去对其他Vir 位点活化的诱导，VirA及 Vir G 的这种调控作用被称为双因子调控体系。 ?Vir H、Vir F及Tzs

这些基因对质粒是特异的，在章鱼碱型中有Vir F、Vir H，在胭脂碱型中有Tzs。

Vir H：对植物产生的某些杀菌或抑菌化合物起解毒作用，从而使自身生不受抑制，可增强致瘤能力。

Vir F：编码一个23KD蛋白，通过Vir 系统传递到植物细胞中，对T-DNA起运输作用。

Tzs：大部分胭脂碱型菌株的Ti质粒上均有Tzs基因，转运玉米素合成酶基因，在细菌中表达后将玉米素分泌到细胞外。该细胞分裂素被植物吸收后，能促进农杆菌感染部位的植物组织脱分化和细胞分裂，提高植物对农杆菌转化的感受性。

三、农杆菌Ti质粒基因转化机理

1. T-DNA的加工及转移

首先在下链25bp重复序列的右边界左起第3和第4碱基间剪切，从缺口的3’端开始合成新的DNA链，并一直延伸到左边界第22bp处。置换出原来的下链，形成ssDNA，即T链。

VirD蛋白的功能：VirD1及 VirD2分别编码16KD和47KD蛋白，与T-DNA的加工有关，决定在边界重复序列的特定位点上形成切口，产生T链断裂。 VirD2蛋白的功能：①特异剪切，并与T链的5’端共价结合。②导向功能；

2.T链蛋白复合体的形成及VirE的功能

T链必须横向跨越细菌细胞膜、细菌细胞壁、植物细胞壁、植物细胞膜及核膜才能整合进植物基因组。

T链以一种DNA-蛋白复合体（T复合体）的形式存在。

目前已知至少两种Vir特异蛋白即VirE2和VirD2与T链蛋白复合体的形成有关。

VirE2的功能：编码ssDNA结合蛋白，该蛋白可非特异地一与任何ssDNA结合，通过与T链非共价结合，VirE2可包被T链形成细长的核-蛋白丝，使ssDNA抗3’和5’外切核酸酶和内切核酸酶。

3、T链复合体通过细菌细胞膜的转运及VirB的功能

（1）VirB的功能

VirB启动子有11个基因，大多数编码跨膜蛋白或膜结合蛋白，能在膜上形成一种类似细菌接合转移时从供体菌转至受体菌所必须的结构——接合孔或性毛。T-DNA通过这种孔由细菌进入植物细胞。同时，VirB也可能起运输和提供能量的作用。按功能，可将VirB蛋白分成五类：

R：在内膜上或内膜内的某些蛋白，可能作为T复合体的受体；

A：此类蛋白可能作为能源，作为一种ATP酶促进T复合体被泵出细菌细胞，VirB11可能是这种A类蛋白。

C：形成通道的作用，如：VirB4是一种富集蛋白，无疏水区，无信号肽，可能在T链转运中起一种结构作用，形成至少一部分特殊的通道结构。

S：载体蛋白，起运载T 复合体穿过通道的作用，这类蛋白可能与所有膜成分（内膜、外膜及周膜）有关。

P：位于外膜上，可能作为结合植物细胞膜的一种受体。

（2）T复合体向植物细胞核的转运

VirD2可能以一种极性方向，将T复合体定向至核孔，而VirE2则作为一种促进因子，保证很长的T复合体在进入核孔时不受干扰。在T-DNA转移过程中，VirD2具有火车头的作用，牵制T复合体以5’端到3’端的方向向核迁移，而VirE2则只助推器的角色，帮助未折叠的长形T复合物不被打断，并方便其向核运动。已知VirE2-ssDNA可以抗拒内切酶的作用，如核酸外切酶VII对VirE2-ssDNA降解能力将相当于对ssDNA的6%，对S1核酸酶的效果也相似。

4、细菌染色体上与T-DNA转移有关的基因

目前已知农杆菌染色体上有10个基因与T-DNA转移有关，它们主要涉及细菌与植物细胞的接触和细菌向植物伤口的趋化性。

chvE——编码一个葡萄糖和半乳糖结合蛋白，主要结合组成植物细胞壁的单糖；可能由于识别植物受伤产生的糖单体，导致细菌向植物伤口的趋化性；在低pH值、磷酸饥饿条件下启动VirG表达。

chvD——编码一种细菌ATP结合蛋白，在低pH值、磷酸饥饿条件下诱导VirG蛋白含量升高，然后VirA接受AS信号，刺激VirG转化成活性形式，启动其他VirG 基因表达。

chvA 、chvB、 chvC——与环状?-1，2-葡聚糖的合成和运输有关； chvB产物催化合成葡聚糖， chvA产物将多糖从胞质运到胞外，影响农杆菌对植物细胞的附着能力。

pscA和Exoc——与多糖的合成有关，并影响农杆菌对植物细胞的附着能力。

四、农杆菌Ti质粒的改造及载体构建

1、野生型Ti质粒直接作为基因工程载体的障碍：

（1）分子量大，160~240Kb；

（2）有各种限制性内切酶的多个切点；

（3）T-DNA区中含有许多编码基因与基因转移无关，如致瘤基因，其存在还会导致植物体丧失形态发生能力；

（4）Ti质粒不能在大肠杆菌中复制。

2、Ti质粒构建的几个重要因素

（1）右边界序列；

（2）完整的Vir基因群；

（3）有独特的酶切点；

（4）有在植物中可表达的选择性基因；

（5）有在细菌中可表达的选择性基因；

（6）章鱼碱型农杆菌品系需要独特的增强子。

3、载体构建

先将T-DN段克隆到大肠杆菌质粒中，并插入外源基因，最后通过三亲交配或接合转

移把外源基因引入农杆菌Ti质粒上。

Ti质粒的载体系统分两类：一元载体和双元载体

例：双元载体的构建

双元载体系统由两个分别含T-DNA和Vir区的相容质粒构成。

（1）构建原理

Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T-DNA的转移，T-DNA和Vir区处于不同的Ti质粒上同样能起到转移T-DNA的作用。

双元载体含有广泛寄主范围质粒的复制起点（oriv），从而代替了在共整合载体中用以重组的同源区，它们能在任何农杆菌寄主里自发复制。所以寄主仅需一套完整的vir质粒就可。主要的转移区载在小重组Ti质粒上。

（2）微型Ti质粒（mini-Ti plasmid）

含有T-DNA边界，缺失Vir基因的质粒；含广谱质粒的复制位点OriV及选择标记基因。

（3）辅助Ti质粒

含Vir区段的Ti质粒，helper Ti,是T-DNA缺失的突变型Ti（卸甲Ti），提供Vir基因功能，反式激活T-DNA的转移。

LBA4404中含有pAL4404(pTiAch5的衍生质粒)，野生型Ti也可做Helper Ti,有更强的毒性。

五、根癌农杆菌侵染植物细胞的机理

1、根癌农杆菌的生物学特性

分类

农杆菌属，也称土壤杆菌属和根瘤菌属，是同属于根瘤科的革兰氏阴性菌。

土壤杆菌属有4 个种：根癌农杆菌、放射形农杆菌、毛根农杆菌和悬钩子农杆菌。

根癌农杆菌，根据其诱导植物细胞产生的冠瘿碱种类不同可分为三种类型即章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型。

生活习性

土壤杆菌属都是土壤习居菌，主要生活在曾被多种植物生活过的土壤中，好氧，但也能在低氧压的植物组织中生长，最适温25~30℃，pH4.0~12.0,最适pH6.0~9.0。形态结构

农杆菌细胞呈杆形，0.8x1.5~3.0μm,以1~4根周生鞭毛运动，不形成芽孢，菌落无色，随菌龄增加，光滑的菌落逐渐变成有条纹，但也有许多菌株生成的菌落呈粗糙型。寄主范围

根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中，根据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根癌农杆菌敏感。裸子植物对该菌同样具敏感性，能诱发肿瘤，对绝大多数单子叶植物无侵染能力。

2、根癌农杆菌侵染的诱导信号及作用机理

（1）酚类化合物

酚类物质——农杆菌浸染植物细胞所必需的诱导物，同时将其作为趋化物来识别。实验证明，一些植物中常见的酚类化合物的混合物都可激活Vir区基因。如：儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、β-羟基苯甲酸、原儿茶酸、香草醛。

Stachel等在烟草叶片的伤口诱出液中确认了两种主要的Vir区基因诱导物：乙酰丁香酮AS和羟基乙酰丁香酮OH-AS。AS效果最好，0.5~1.0μmol/L即可诱导Vir活化。

（2）中性糖和酸性糖

中性糖在Vir基因诱导和致病毒力中也起重要作用。Shimoda等人，在限定AS诱导条件下，

发现许多中性糖（L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、D-塔罗糖、2-脱氧-D-葡萄糖）都可增强一些Vir区基因的诱导。这些中性糖是通过chvE和VirA起作用，chvE编码葡萄糖和半乳糖结合蛋白，识别伤口产生的糖单体，导致农杆菌的趋化作用。

酸性多糖是组成植物细胞壁中果胶质的主要成分。最近的实验证明，酸性糖（胡萝卜根提取物中蒸馏出来）可改变农杆菌基因的表达。蛋白质标记实验表明，至少有10种蛋白质合成被其诱导，一种被阻遏。

（3）pH值

5.0~5.5的低pH值。诱导物对pH的要求是<.6.0, 在农杆菌培养在含有酚类化合物（AS）的培养基中时，pH5.0 ~5.8Vir的诱导达到一个最高水平

3、根癌农杆菌的侵染能力及其特异性

（1）常用的根癌农杆菌

胭脂碱型（Nop）菌株：染色体背景为C58，生长快，不结球，转化中容易操作，常用的菌株有C58、pGV3850、A208SE等。

章鱼碱型（Oct）菌株：染色体背景为Ach5，生长慢，结球，转化中难操作，培养后不易洗掉，常用的菌株有LBA4404,LBA1010,GV2260,GV3111SE,K61等。

农杆碱型（Agr）菌株，也称琥珀碱型（Suc）：染色体背景为A281或A136，具有胭脂碱型菌株的特点，以A136为染色体背景的常用菌株是EHA101，生长快，不结球，侵染能力强，常用的菌株有A281、EHA101、EHA105等。

（2）、根癌农杆菌的侵染能力差异

根据侵染能力大小将农杆菌分为：

广宿主菌株：大多数双子叶、若干裸子植物、少量单子叶植物；如：pTiB0542、pTiA6；窄宿主菌株：有限的几种植物上诱发肿瘤，如pTiAg162,仅能在葡萄的几个品种上诱发肿瘤。不同植物对农杆菌侵染的敏感性不同，在转化中，二者的选配十分重要，要选农杆菌与植物之间有高侵染力的配合。如：杨树茎，用C58优于LBA4404；苹果，6种基因型比较，叶：EHA101（pEHA101）优于LBA4404，C58；茎：A281优于C58，ACH5，A348。

农杆菌的染色体背景对宿主范围同样有着重要作用。因为除Vir区功能外，农杆菌对植物表面识别与结合有关的功能还取决于农杆菌染色体上基因位点。农杆菌所展示出不同的生长速率、多糖产生和对植物细胞的毒力都会影响转化率和宿主范围。

六、根癌农杆菌转化程序及操作原理

1、根癌农杆菌Ti质粒转化的基本程序

（1）选择适宜的培养基，使创伤部位能产生尽可能多的再生植株。

（2）确定供体植物最适的培养条件。

（3）确定最佳外植体类型、大小、部位等：再生途径，愈伤组织起源（细胞类型、层次），

保证转化愈伤组织和芽原基由创伤部位的浅层细胞发育而来。

（4）确定适宜的抗生素水平：抑菌抗生素Cef ，Cb ，能抑制细菌生长，还能保证愈伤组

织正常生长和分化。

（5）确定选择压力的最低水平。

（6）优化农杆菌接种和共培养条件改进筛选条件，促进抗性细胞恢复再生能力：采用无毒的生化物质。

2、根癌农杆菌的培养、纯化、保存及工程菌液的制备

（1）农杆菌的培养

常用的农杆菌培养基有 LB、 YEM、 YEB、 TY、 523、PA及 MinA等培养基。

这些培养基中，LB、YEB、YEM及523属富集培养基，其营养成分丰富，包括有各种有机成分。在这些培养基中农杆菌生长快，分裂旺盛，它们是常用制备工程菌液的培养基。 ? PA和 TY培养基是属营养较好的培养基，氨基酸及碳源、氮源都很丰富。农杆菌在这些培养基上生长也很快，是常用的农杆菌选择培养时的培养基。

MinA培养基与前几种培养基有明显差异：只提供必要的无机盐，并用葡萄糖和（NH4）2SO4 提供碳源和氮源。

Minimal只用相应的冠瘿碱如 NOpaline、 Octopine等取代蔗糖、氨基酸和无机氮作为农杆菌的碳源和氮源。

农杆菌在MinA和Minimal培养基上生长较慢。在进行三亲杂交时通常用这两种培养基，并加相应的抗生素选择转化的农杆菌。含重组质粒的大肠杆菌及含辅助质粒 pRK20 13的HB101因不能利用冠瘿碱作为碳源和氮源而不能生长，同时还存在抗生素的选择，因此有利于选择转化的农杆菌的`生长。

农杆菌的生长周期

农杆菌培养方式：分为固体平板培养和液体振荡培养，

固体培养一般需2～3d，液体培养生长更快，一般需1～2d。

农杆菌接种在培养液后，并不立即开始增殖。一般在25～30℃时，需1～2 h细菌才开始分裂。

当生长开始后，细菌数目以一恒定的指数速率倍增，直至培养基成分改变和供氧缺乏时才停止增殖。当细菌增长速率达到对数指数时称之为对数生长状态。

当细菌密度达到 177／ml时，空气中的氧气便难以很快地扩散到细胞内。在振荡或通气条件下培养，细菌浓度也很少超过 2～3 X 109／ml。

测定农杆菌浓度的方法：最简单的方法是光密度测定法。将菌液装入比色杯汽在分光光度计上选用600nm波长测定其OD值。光密度与浓度换算公式是1OD约等于 8 X 108／ml。

（2）工程菌的纯化

纯化菌种的方法主要采用常规的微生物纯化方法，即划线法。用接种针划线，然后用石蜡膜封口，将平皿倒置放恒温箱内，在25～28℃条件下培养过夜，次日或即日看到分离的单菌落。挑取单菌落接种在液体培养基内进行液体振荡培养。

（3）工程菌侵染悬浮液的制备

液体振荡培养的工程菌，通常培养 12～24 h后即可达到对数生长期。用离心管取一定数量的菌液进行4000r／min离心，倒掉上清液，再加入植物外值体诱导愈伤组织或分芽的液体培养基，使其光密度OD值达到0．5，即可用作接种外植体的工程菌液。

注意：因为农杆菌培养基中通常含有抗生素，它对外植体的生长、脱分化或分化有不良影响，放需通过离心除去细菌培养基，加入植物培养基。也有的做法是，将农杆菌加入植物培养基后再振荡培养 12 h，当细菌生长达到对数生长期后再离心，倒掉上清液，用新的植物液体培养基稀释至一定OD值，再作为工程菌液使用。

（4）工程菌的保存

菌种的保存的目的是创造一个适合细菌休眠的环境（低温、干燥、缺氧），使其得以长期保存。其功能在于尽量减少菌株的传代次数；使菌种经保存后不死亡、不污染杂菌，并保持其原有性状，降低菌种的变异率；最终目的是的基因不能丢失。

菌种保存的方法根据其保存时间长短可分为三种方法：

短期保存〔数月）：采用斜面或平板保存法。斜面菌种置于4℃可保存数月，平板用石蜡膜密封后也可在低温0～4℃下放置数月。

中长期保存（数年）：中长期保存采用穿刺法，这是一种菌种接入柱状培养基的方法。经常应用的是半固体柱状培养基，用接种针沾取少量问后直接插入柱状培养基中。需注意的是，要从培养基中间插入，直插到接近管底，但不要穿透培养基，再慢慢按原途径拔出接种针，切勿搅动，以免使接种线不整齐而影响观察，甚至会因用力搅动造成空隙太大进入空气，而影响保存效果。穿刺培养的菌种用蜡封口，在室温下可保存数年。

长期保存菌种：主要采用甘油保存法。在7％二甲基亚（DMSO）或 15％甘油中，菌种可于- 70℃冰箱或液氮中长期保存。当甘油含量增加40～ 50%时，细菌可在- 20℃或- 70℃条件下，保存若干年而不失活。将冰冻菌种从冰柜中取出时，应当放在冰浴上慢慢融化，不可直接将其放室温下，否则会导致菌体失活，更不能直接接种至液体培养基内28℃振荡培养。

3、Vir基因活化诱导物的使用

（1）诱导物：

常用诱导物是乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮（OH－AS），其中效果优是AS。但最近又有新的发现，有两种特殊化合物比AS的诱导活性高10～100倍。

（2）诱导物的使用方法

在农杆菌液体培养时加 AS，加入时间－般在制备工程菌浸染液使用前4～6 h加入。使农杆菌既处于对数生长期，又处于vir基因高度活化状态，从而提高侵染能力。也有的在农杆菌悬浮液离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入。

AS加在农杆菌和外植体共培养的培养基中。共培养的过程是Ti质粒实现 T-DNA转化时期。一般农杆菌附着 16 h后才能进行转化，这时需要vir基因的高度活化。因此，许多科学家赞成这种使用方法。

在农杆菌液体培养基中及共培养基中都加入AS。这种方法似乎最牢靠，只不过是使用的AS诱导剂太多了。

（3）诱导物使用的pH值

pH值对vir区的活化有着明显的影响，从理论上讲含AS的培养基pH值为5．0～5．6时， Vir区基因的诱导达到最高水平。

pH值改变 0．3，即对多种植物的转化率有明显影响。

章鱼碱型和农杆碱型菌系比胭脂碱型和琥珀碱型需要更低的pH值。

通常农杆菌培养时pH值为7．2。这种生长旺盛的菌株的vir基因均处于不活化状态。而组织培养基中的pH值常为5．8，有利于vir基因的活化。在vir基因活化诱导中应调整培养基的pH值。

4、外植体的选择

Mayer等指出，转化只发生在细胞分裂的一个较短的时期内，可能只有处于细胞分裂周期的S期才具有外源基因的转化能力，因为核基因组DNA正在复制时才能使外源DNA整合。因此细胞具有分裂能力是转化的基本条件。

（1）外植体的种类

叶片、叶柄、子叶、子叶柄、下胚轴、茎、花茎、匍匐茎、块；茎尖分生组织、芽、根、合子胚或体细胞胚，以至成熟的种子等都可作为外植体转化。但各种外植体材料的转化率有明显差异。

最佳共培养的时间：

农杆菌转化时，并不“侵入”到植物细胞中去，而是把T－DNA转移到植物细胞。农杆菌附着后不能立即转化，只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤，这一段时间称为“细胞调节期”。因此，共培养时间必须长于 16h。共培养时间太长，由于农杆菌的过度生长，植物细胞因受到毒害而死亡。共培养时间对转化率有着很大影响，而且不同物种、外植体种类、农杆菌菌株的最佳共培养时间不同。

确定最佳共培养时间的方法主要采用gus基因瞬时表达测定法，即共培养后定时测定外植体的gus基因颜色反应，统计瞬时表达率及表达面积，以表达率高，表达面积大为优。同时还要考虑外植体的受损害程度，以保证外植体的旺盛生长为直。最后还要以获得的转化愈伤组织频率或转化不定芽频率为最终依据。

农杆菌的增殖适度

在共培养时农杆菌增殖生长不良，外植体切口边缘只有很少的农杆菌生长，则转化的机率很小。反之，农杆菌在外值体四周过度增殖，可引起对外植体的毒害，致使其褐化死亡。控制农杆菌增殖适度的原则是既要使菌株在外植体边缘特别是切口面旺盛增殖生长，又不应过度，一般以覆盖切口面为适度。控制农杆菌增殖的方法有以下几种：

1）调整工程菌液的浓度，生长太快则应降低菌液浓度。

2）控制共培养时间，农杆菌的增殖生长适度也是确定共培养最佳时间的指标，共培养时间太长可造成农杆菌过度生长。

3）使用抗生素调控农杆菌的增殖生长。一种方法是在共培养基中加入适量的抗生素如羧苄青霉素或头孢霉素。另一种方法是共培养2～3d后的外植体需用含抗生素的液体共培养基充分洗涤，以除去过量的农杆菌，然后转到新鲜的共培养基上继续共培养。共培养结束时若仍存在农杆菌过度增殖，则可再用上述洗涤培养基充分洗涤后进行愈伤组织诱导或不定芽分化培养。共培养中激素的影响

共培养时培养基中是否加激素，文献报道不一，有的不加激素，有的则认为加激素后促进外植体细胞分裂，保持细胞活力，也有利于转化后细胞的生长，从而提高转化率。

如 Mansur等（1993）用 A281菌株与花生叶片外植体共培养时，加激素比不加激素的肿瘤诱导率提高约 30％。

目前大多数研究者采用加激素的方法，而且共培养基与愈伤组织诱导或不定芽诱导培养基相同。

（4）外植体脱菌及选择培养外植体的脱菌培养脱菌培养，即把共培养外植体转移到含有抗生素的培养基上。常用的脱菌抗生素有羧苄青霉素（Carb）、头孢霉素（Cef）等。这些抗生素不仅对农杆菌有杀伤或抑菌作用，而且对植物细胞同样有一定的生物效但对不同植物的不同外植体产生的影响不同。

Holford 等（1 992 ）指出，Carb 的分解物为生长素及苯乙酸，因此 Carb 可刺激愈伤组织的增殖。Howe 等（ 1994 ）观察到对杨树的愈伤组织诱导有抑制作用。在甘蓝研究中发现，Carb 抑制根分化，Cef 抑制芽分化，因此芽分化阶段需用Carb，生根阶段则用Cef。抗生素的使用浓度一般为500mg／L 左右。其使用原则是在达到抑制农杆菌生长的目的后，尽量降低其浓度。

脱菌培养的时间：脱菌培养的时间，一般需5～6次继代培养，但仍然不能把残留的农杆菌杀死，特别是共生在维管束和细胞间隙中的农杆菌。如果停止使用抗生素后的外植体又有农杆菌可再使用抗生素脱菌。也有的植物一直使用抗生素，直到试管苗形成。

（5）转化体的选择培养

?选择压：选择抗生素如 Km，加入选择培养基后，对细胞的生长产生一种选择作用，

称之为选择压。加入的抗生素浓度愈大，选择压也愈大。选择培养基中抗生素的浓度，即选择压的强度，也要根据植物的特性而定，较敏感的植物要用较低的 Km浓度。一般浓度范围是 Km 50～ 100mg／L， hpt 10~20mg／L， ppt 5～20mg／L。

?选择的方法：前期选择、延迟选择和后期选择。

前期选择：就是外植体共培养后，在转入愈伤组织或不定芽诱导的一开始就加入选择压，相当于前面讲到的先选择后再生。

延迟选择：当愈伤组织和不定芽诱导培养时开始不加选择压，过一周或一定时间后再加入选择压，这样既有利于转化细胞生长又不会产生更多的嵌合体后期选择：即相当于前面说的先再生后选择，有利于提高转化率。

选择培养过程中转化和再生细胞的一致性

在选择培养条件下再生细胞和转化细胞是否一致，关系到能否得到真正的转化，只有同时具有再生和转化潜力的细胞才有可能分化成转基因植株。因此再生部位和可被转化的细胞部位应该发源一致，反之得到的可能是假转化体。假转化体在继代选择培养基上生长不良而死亡，或呈白化。

七、根癌农杆菌Ti质粒转化的方法

1、整体植株接种共感染法

该途径是模仿农杆菌天然的感染过程，人为地在整体植株成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤面上，或用针头把农杆菌注射到植株体内，杆菌在植株体内进行侵染实现转化，获得转化的植物细胞，因此也称之为体内转化。为了获得更高的转化频率，一般采用无菌的种子实生苗或试管苗。它是最简便的转化法。

优点：

实验周期短；

充分利用了这些无菌实生苗的生长潜力；避免在转化中其他细菌的污染；菌株接种的伤口与培养基分离，以免农杆菌在培养基上过度生长，允许在无抗生素的培养基上进行；

具有较高的转化成功率。

缺点：

转化组织中常混有较多未转化的正常细胞，即形成严重的嵌合体；需要大量的无菌苗材料；转化细胞的筛选比较困难。

2、叶盘转化法

（1）叶盘法转化的操作

打孔器从消毒叶片上取得叶圆片

叶盘在过夜培养的对数生长期的农杆菌的菌液中浸数秒种后，置于培养基上共培养待菌株在叶盘周围生长至肉眼可见菌落时再转移到含有抑菌剂的培养基中除去农杆菌。

同时在该培养基中加入抗生素进行转化体选择，3~4周培养可获得转化的再生植株。

优点：操作简单、重复性高、适用性广（2）转化苗的保持与繁殖

主要采用两条途径实现转化苗的保持与繁殖。

营养繁殖途径，它包括试管苗的无性快速繁殖及嫁接、扦插等田间的无性繁殖方式。该途径保持繁殖转化苗时应注意如下：

①正确使用激素浓度，低水平的激素能有利于保持外植体活力，并刺激休眠侧生分生组织的发育及侧枝形成。适当提高分裂素浓度有利于芽的分化，形成原始转化苗的无性系克隆。因此可根据实验目的选择细胞分裂的浓度。

②为消除残留的农杆菌在繁殖培养基中加入抑菌抗生素是明智的种子繁殖：

这对于转基因植株的正常表达、遗传特性及向生产化过渡具有重要作用。该途径的主要操作是将转化试管苗在小花盆中移栽成活，然后转入田间，开花时套袋隔离防止杂交授粉及向环境中释放转化的花粉。结种后注意收割种子，保存。

3、原生质体共培养转化方法

（1）操作步骤：

①从叶片分离原生质体，在26t下暗培养24 h，然后转移到2000lX下继续培养48h；

②在细胞即将分裂，新的细胞壁物质已经形成时，加入活化的农杆菌悬浮液。农杆部原生质体的比例以1：1000左右为宜。共培养约2～3 d；

③再加入选择标记的抗生素对转化体进行选择培养约3～4周后可产生肉眼可见的小块转化愈伤组织；

④将小块愈伤组织转移到固体培养基上再生愈伤组织，此时继续保持选择压力，以便保证只有转化愈伤组织才能不断生长；

⑤将转化愈伤组织转入固体分化培养基，获得转化再生植株。其他步骤与叶盘法相同。

（2）原生质体共培养法的优点及一些技术问题原生质体的密度一般以105～106个／ml为宜。

在农杆菌和原生质体共培养期民农杆菌附着在原生质体上，超过32小时之后方可除菌洗涤，也就是要有一定的附着时间。

原生质体出现新形成的细胞壁物质是农杆菌转化的基本条件，这是因为细胞壁物质与农杆菌的附着有关。未形成新细胞壁物质的原生质体没有农杆菌的附着，也没有转化进行。在共培养过程中，某些二价阳离子（Mg2+）为农杆菌的附着和转化所必需。二价离子的整合物EDTA可以抑制农杆菌对植物细胞壁的吸附及转化作用，因为上述 Mg2+（不是 Ca2+）与农杆菌附着到植物细胞壁有关。共培养转化似乎是在单细胞或二细胞阶段发生，因此获得的转化愈伤组织大部分是来自一个细胞。

八、癌农杆菌转化系统的评述

优点：

成功率高，效果好。该转化系统是模仿或称之为利用天然的转化载体系统，不管是用菌株接种整体植物的伤口，还是直接侵染离体培养细胞，通常都可以获得满意的转化频率。

在所有的转化系统中，Ti质粒转化系统是机理研究得最清楚的，方法最成熟，应用也最广泛。

Ti质粒的T-DNA区可以容纳相当大的DN段插入，目前已把长达50kb的异源DNA序列通过T－DNA完整地转移到植物细胞中。

T－DNA上含有引导DNA转移和整合的序列，以及能够被高等植物细胞转录系统识别的功能启动子和转录信号，使插入到T-DNA区的外源基因能够随同T-DNA一道在植物细胞中表达。

可根据人们的需要连接不同的启动子，使外源基因能够在再生植株的各种测器官中特异性表达，例如在果实中表达，在叶中表达，甚至仅在根中表达，即可进行人为地控制。

农杆菌Ti质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好，并且多数符合孟德尔遗传规律，因此转基因植株能较好地为育种提供了中间选育材料。

缺点：根癌农杆菌Ti质粒载体系统作为一个植物基因转化载体系统的不足之处是它主要用于双子叶植物，如何扩大其应用范围如禾谷类、裸子植物等，一直是人们所关心问题。

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