动物细胞培养（通用10篇）由网友“me自闭基罗”投稿提供，以下是小编为大家准备了动物细胞培养，欢迎参阅。
篇1：动物细胞培养
说课稿
说教学目标
根据学生的认知特点及教材要求特制定以下目标：
1、知识方面
篇2：动物细胞培养
⑵动物细胞融合（知道）
⑶单克隆抗体的制备及应用（知道）
2、态度观念方面
⑴初步培养学生勇于探索，不断创新的精神和合作精神。
⑵通过向学生介绍几大动物细胞工程的发展动态及一些新的研究成果，使学生明确人们对生命奥秘的揭示愈加广泛和深入，知识不断更新并向前发展。认识到学无止境，形成终生学习的意识。
3、能力方面
⑴在学习动物细胞培养过程中，学生通过阅读、自学、质疑、讨论、训练、总结等环节，逐步提高获取知识的能力、逻辑思维能力、分析问题和解决问题的能力。
⑵由植物细胞杂交技术导出动物细胞融合过程，培养学生的'知识迁移能力、思维能力。
说教学内容
单克隆抗体既是本节重点也是难点
分析：动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等。其中前三大技术为本节教材的主体内容，而胚胎移植、核移植技术以小字科普读物的形式出现，意在使学生在有所侧重的前提下对动物细胞工程发展概况有一个较全面的了解。在教材重点介绍的三大动物细胞工程技术中，动物细胞培养是其他技术（如单克隆抗体、胚胎移植、核移植等）的基础，其价值更多的是通过其他技术成果来体现的。而动物细胞融合技术目前较为成熟的最重要的用途便是制备单克隆抗体。由此可见，单抗技术应属较高层次的动物细胞工程技术。对他的学习有助于学生较深刻的领悟动物细胞工程的真谛，并从两位诺贝尔奖获得者对单抗独具匠心的实验设计中，深刻体会科学态度、科学方法，尤其是创造性的思维品质在科学研究、发明创造中决定性作用。基于以上认识，单克隆抗体应列为本节的重点内容。同时单克隆抗体技术本身环节多、技术复杂，加之学生对此缺乏必要的认识，所以也是本课的难点所在。
说教学方法
鉴于学生的学习特点及本节内容设计以下教学方法：指导学生自学动物细胞工程的原理、过程从中得到一些概括性的认知、启发他们进行对比联系、师生共同探究新科技、新成果。
篇3：动物细胞培养(网友来稿) 教案教学设计
说课稿
说教学目标
根据学生的认知特点及教材要求特制定以下目标：
1、知识方面
⑴动物细胞培养（知道）
⑵动物细胞融合（知道）
⑶单克隆抗体的制备及应用（知道）
2、态度观念方面
⑴初步培养学生勇于探索，不断创新的精神和合作精神。
⑵通过向学生介绍几大动物细胞工程的发展动态及一些新的研究成果，使学生明确人们对生命奥秘的揭示愈加广泛和深入，知识不断更新并向前发展。认识到学无止境，形成终生学习的意识。
3、能力方面
⑴在学习动物细胞培养过程中，学生通过阅读、自学、质疑、讨论、训练、总结等环节，逐步提高获取知识的能力、逻辑思维能力、分析问题和解决问题的能力。
⑵由植物细胞杂交技术导出动物细胞融合过程，培养学生的知识迁移能力、思维能力。
说教学内容
单克隆抗体既是本节重点也是难点
分析：动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等。其中前三大技术为本节教材的主体内容，而胚胎移植、核移植技术以小字科普读物的形式出现，意在使学生在有所侧重的前提下对动物细胞工程发展概况有一个较全面的了解。在教材重点介绍的三大动物细胞工程技术中，动物细胞培养是其他技术（如单克隆抗体、胚胎移植、核移植等）的基础，其价值更多的是通过其他技术成果来体现的。而动物细胞融合技术目前较为成熟的最重要的用途便是制备单克隆抗体。由此可见，单抗技术应属较高层次的动物细胞工程技术。对他的学习有助于学生较深刻的领悟动物细胞工程的真谛，并从两位诺贝尔奖获得者对单抗独具匠心的实验设计中，深刻体会科学态度、科学方法，尤其是创造性的思维品质在科学研究、发明创造中决定性作用。基于以上认识，单克隆抗体应列为本节的重点内容。同时单克隆抗体技术本身环节多、技术复杂，加之学生对此缺乏必要的认识，所以也是本课的难点所在。
说教学方法
鉴于学生的学习特点及本节内容设计以下教学方法：指导学生自学动物细胞工程的原理、过程从中得到一些概括性的认知、启发他们进行对比联系、师生共同探究新科技、新成果。
[动物细胞培养(网友来稿) 教案教学设计]
篇4：《动物细胞培养和核移植技术》教学反思
席妍妍
动物细胞培养和核移植技术是动物细胞工程的基本操作，通过分析本节教学内容相对简单但是新名词较多，比如原代培养、传代培养、细胞株、细胞系以及核移植、胚胎移植等，是本节课的重点也是难点问题，学生容易混淆出错。模型建构这种学习方法具有形象，系统，直观的特点，尤其是概念模型有助于将知识系统化，因此在本节的教学中运用概念模型建构的方法攻克难点，分析学生情况，经过三个学期的训练，学生已具备基本的生物学知识，大多数学生具有生物学思维方式，对概念模型的建构也有所了解，因此该教学方法可行。
教学实施情况：本节课通过问题情境导入，学生在利用经验解决问题的`过程中引发新的疑问，怎样获得大量的自体皮肤？引出动物细胞培养，学生讨论激烈，效果良好。第二阶段在先自学动物细胞培养的概念，分析得出原理，在得出原理时出现困难的学生较多，可见学生联系运用所学知识的能力不足；过程的学习通过讨论完成模型建构为主，学生讨论激烈，大部分小组能完成这一模型的建构，但仍有学生不会画概念图，最后的培养条件及应用集体学习，效果良好。第二阶段核移植技术的学习同样以模型建构的方式进行，通过前一阶段的训练，该过程完成较好，学生基本都能独立完成核移植技术的流程图。
总之本节课效果相对较好，但仍存在基础不够扎实，模型建构能力有待提高，提取信息能力不足的问题，在以后的教学中应针对问题重点训练，力争教学效果进一步提高。
篇5：动物细胞培养和核移植技术高中生物教案
教学目标
(1)简述动物细胞培养的过程和条件。
(2)简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和前景。
2.目标解析
(1)简述动物细胞培养的过程和条件及简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和前景就是指了解两个过程的基础上通过理解来记住相应技术的条件或前景。
【问题诊断分析】
在本节课的教学中，学生可能遇到的问题是无法分析出动物细胞培养的条件，产生这一问题的原因是前面所学内环境的知识不能很好的迁移和运用。要解决这一问题，就要通过复习回顾内环境的相关成分和稳态的意义，其中关键是对内环境稳态意义的理解。
【教学支持条件分析】
在本节课的两个过程的教学中，准备使用幻灯片，有利于更形象的以图文并茂形式板书出来。
【教学过程】
问题1：动物细胞工程的常用技术手段有哪些?最基础的技术手段是什么?
设计意图：(1)、对预习的检测并引入新课.
师生活动：(1)什么是动物细胞培养?
(2)什么是细胞贴壁?什么是接触抑制?
(3)如何打破接触抑制?
(4)细胞传代培养代数有什么特点?动物细胞培养技术能应用于那些方面?
(5)动物细胞培养需要什么条件?
(6)如何保证无菌、无毒环境?
[例题]1.为了使用于培养的动物组织细胞分散开以便配制成一定浓度的细胞悬浮液，选取来的动物组织应选用下列哪种物质处理
A.胃蛋白酶
B.胰蛋白酶
C.盐酸
D.胰脂肪酶
[例题]2.下列属于动物细胞培养与植物组织培养主要区别的是
A.培养基成分不同
B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行
C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能
D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株
问题2：克隆动物采用的是什么技术? 为什么不能直接利用动物细胞培育动物体?
设计意图：(1)、让学生理解为什么要进行动物核移植.
师生活动：(1)什么是动物体细胞核移植技术?
(2) 受体细胞为什么选用卵母细胞
(3) 细胞核移植技术的意义是什么?
(4) 体细胞核移植技术存在的问题?
(5)体细胞核移植技术有那些应用?
[例题]3.在克隆多利羊的过程中，下列哪项技术没有运用到
A.细胞培养技术
B.细胞核移植
C.胚胎移植技术
D.基因工程技术
【课堂小结】
动物细胞培养和核移植技术
1)动物细胞培养：
1、概念：2、过程：3、条件：
2)动物体细胞核移植技术和克隆动物
1、概念：
2、过程：
3、细胞核移植技术的应用前景：
4、体细胞核移植技术存在的问题：
篇6：动物细胞培养和核移植技术高中生物教案
学习新课：
一、动物细胞培养
(1)概念
(2)原理
(3)过程
(4)条件
(5)应用
二、动物体细胞核移植技术和克隆动物
(1)概念
(2)分类
(3)原理
(4)过程
(5)应用
(6)局限
4、小结
5、作业或活动 师：同学们，前面我们一起学习了植物细胞工程的相关知识，请大家来回顾一下其涉及的主要技术手段。
生：有植物组织培养和植物体细胞杂交等。
师;今天我们开始一起来学习动物细胞工程的内容，请大家阅读课本P44引言，介绍动物细胞工程的常用技术手段：动物细胞培养、核移植技术、动物细胞融合、生产单克隆抗体等，其中动物细胞培养技术是基础技术。现在先来学习动物细胞培养和核移植技术
师：为什么要进行动物细胞培养?
生：(沉默)
师：我们一起来看课文本小节的引言的两个实例。
师：同学们，要解决这些问题，离不开动物细胞培养技术。那么什么是动物细胞培养呢?
生：(情绪高涨)从动物机体中取出相关组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。
师：很好!从概念中我们不难看出，该技术实施的原理是什么?
生：细胞增殖。
师：怎样进行动物细胞的培养?需要哪些条件?
指导学生阅读P44-46内容，结合插图或投影过程示意图，最好能制成动画。师生共同归纳过程：
取材→分散→配制悬液→原代培养→传代培养。在各个箭头上注明处理方法。
注意：原代培养和传代培养
原代培养：取材水解后的初次培养;
传代培养：原代培养后再处理后的后续培养。两者先后关系，不能倒置，其原理相同。后者一般至10代，也有至40-50代，但细胞核型可能会改变，从而癌变。
师：大家想一想，目前使用的或冷冻保存的细胞常常是10代以内，是什么道理?
生：以保证细胞正常的二倍体核型。
师生讨论P44的两个旁栏思考题
复习：内环境及其稳态知识，并思考和讨论以下问题：
体外细胞培养需要哪些营养物质?需要怎样的合适环境条件?
(阅读讨论后)
环境条件：灭菌处理、抗生素、定期更换培养基
营养条件：与体内基本相同，有糖、氨基酸、无机盐、必需元素、血清、血浆等
温度和PH： 接近体温，PH7。2-7。4
气体环境：O2和CO2(5%)
师：物细胞培养能否象植物组织培养那样获得克隆个体?
生：众说纷纭。
师：不能，因为动物细胞的全能性受到分化程度的限制，发育成个体的潜能渐弱。那么这项技术有哪些用途呢?
(1)生产生物制品
(2)提供基因工程的受体细胞
(3)检测有毒物质的毒性
(4)用于病理、生理、药理研究
比较：培养基的状态、成分;技术依据的原理;过程;结果等方面。
师：刚才我们讲过利用上述技术无法克隆动物个体，那么能否克隆?有没有别的方法?
生：有(声音洪亮)
师：大家说得对!什么方法?
生：动物核移植技术。
板书概念内容(略)
师：胚胎细胞核移植和体细胞核移植，后者难度较大。我们来学习后者。
篇7：软骨细胞培养及其调控
软骨细胞培养及其调控
关键词：软骨细胞
自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来 ［1］，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。 实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨［2］。虽 然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所 表现出的生物学特性也有差别。软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持 表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其 细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。软骨细胞的生长密度对其 生长也至关重要。在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分 裂经过和形态功能完全不同。组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分 泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌 或旁分泌信号的方式而存活。
1 细胞因子对体外培养软骨细胞的影响
软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外 大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的.发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益 深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培 养研究又提出了一个新方向。近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化 等的影响研究也较多。也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细 胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进软骨细胞增殖和基 质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL- 1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下 ：
1.1 转化生长因子beta(TGF-β)
TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。T GF-β可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞。现已实验证明TGF-βs具有促进软骨细胞增 殖、调节其分化和胞外基质合成的能力［3］。F.Redni等实验证明培养兔关 节软骨细胞表达了不同的TGFβ受体且与软骨细胞生长周期功能有关，软骨细胞在S期表现了 低亲和力受体表型(kd=appiox 1100pm)然而GO/G期的软骨细胞表现了高亲和力受体。因此 ， TGF-β对软骨细胞的作用有多种受体参与。同时也有实验证明TGF-β更多的结合在GO/G1 期比S期的同步化软骨细胞，从而说明TGF-βs对软骨细胞的作用是通过 不同的途径［ 4］。也有学者证明TGF-βs在不同的条件下对成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重 作用，1-10ng/ml浓度的TGF-β可诱导大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成特异性的Ⅱ型 胶原和蛋白多糖，而在0.4mol/L浓度下，TGF-β可诱导大鼠颅骨成骨细胞的碱性磷酸酶 活 性，减少软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成［5］。同时也有实验证明TGF-β可 抑制培养兔关节软骨细胞的终末分化及钙化。TGF-β可能与多种因素如胞外基质和其它分 化调控生? ひ蜃硬斡攵韵赴?牡鹘谧饔茫?］。TGF-β在细胞对其它各种分化信号 的应答过程中同样也有调节作用。Wen-Ning Qi等实验证明Ⅱ型胶原能特异的调节TGF- β刺激软骨细胞合成Ⅱ型前胶原DNA和蛋白多糖，同时说明Ⅱ型胶原在TGF-β存在的条件下 调节软骨细胞特异性基因表达具有剂量依赖
[1] [2] [3] [4] [5] [6]
篇8：细胞培养求职简历
姓名：本网
两年以上工作经验|男|26岁(1990年7月7日)
居住地：广州
电 话：134*******(手机)
E-mail：
最近工作[11个月]
公 司：XX有限公司
行 业：制药/生物工程
职 位：细胞培养
最高学历
学 历：本科
专 业：生物资源科学
学 校：华南理工大学
求职意向
到岗时间：可随时到岗
工作性质：全职
希望行业：制药/生物工程
目标地点：广州
期望月薪：面议/月
目标职能：细胞培养
工作经验
/8 – /7：XX有限公司[11个月]
所属行业：制药/生物工程
生产部 细胞培养
1. 对培养方式及操作进行优化，降低污染的风险，完善操作流程;
2. 组织协调临床样品的生产工作，提供临床实验样品;
3. 生物反应器及相关配套设备的日常维护和一般保养工作;
4. 参与新药注册申报中相关文件的起草及资料归纳收集工作。
/5 – 2014/6：XX有限公司[1年1个月]
所属行业：制药/生物工程
品保部 生物制药
1. 负责发酵罐系统的'选型,购买以及安装调试工作;
2. 进行毕赤酵母的小试和中试工作;
3. 新员工培训指导;
4. 生产物料申购及盘点。
教育经历
/8— 2013/6 华南理工大学 生物资源科学 本科
证书
/12 大学英语四级
语言能力
英语(良好)听说(良好)，读写(良好)
自我评价
本人诚实守信，工作严谨踏实，认真负责，处事机灵。拥有积极向上的生活态度和广泛的兴趣爱好，具有良好的心理素质和吃苦耐劳精神，对事有自己的见解，并有较强的共事协作能力。
篇9：TCB4-1细胞培养技术+-2-
?动物细胞与组织培养
是从动物体内取出细
胞或者组织，模拟体
内的生理环境，在无
菌、适温和丰富的营
养条件下，使离体细
胞或者组织生存、生
长并维持结构和功能
的一门技术。
5
6
每代贴附生长细胞的生长过程?游离期
?贴壁期
?潜伏期
?对数生长期
?停止期（平台期）
7
8
游离期：
细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
9
10
贴壁期：
?细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10 min－4 h贴壁。
底物：胶原、玻璃、塑料、其他细胞等。?血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。?进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的
11功能基团）。
12
潜伏期：
此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性。13
倒置显微镜
?一般观察：
?培养液颜色（CO2、pH指示剂）桃红色－正常；橙黄色－较好；
淡黄色－时间过长、营养不足、细胞死亡紫红色－死亡
?细胞透明度
颗粒物、空泡、胞膜
14
15
图受精卵的全能性
16
图植物细胞的全能性
17
What is the stem cell？
细胞在分化过程中往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞，称之为干细胞。一旦需要，这些干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化细胞。
18
?Tree of Embryon
Development
Mesoderm: 中胚层Endoderm: 内胚层Ectoderm: 外胚层Implantation: 植入Uterus: 子宫19
20
Totipotent cells: 全能细胞
Pluripotent stem cells:
多能干细胞
图干细胞的分化潜能
21
分类
?按分化能力的大小，干细胞可以分为：
?全能干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。胚胎干细胞就属于此类，它具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，从而可以进一步形成人体的任何组织或器官。
22
?专门型干细胞，只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。利用专门型干细胞培育人体细胞和组织的研究已经取得了一定成果，但利用前景更广阔的，还是分化能力最强的全能干细胞。如果能源源不断地获得这种全能干细胞，就可以在体外诱导产生不同的组织细胞甚至器官供移植。
23
胚胎干细胞生物学特征：
?具有早期胚胎细胞相似的形态特征，核型正常，保留了正常二倍体的性质；?具有无限增殖的能力；
?具有发育的多潜能性；
?具有种系传递功能；
?具有培养细胞所有的特征，可在体外培养、克隆、冻存及进行遗传操作。
24
材料
?PMSG（孕马血清）、HCG（绒毛膜促性腺激素）、DMEM 培养液
?2+无CaPBS 缓冲液；磷酸盐缓冲液（PBS 液）；0.125 %胰酶EDTA 混合液；丝裂酶素C2+、Mg
?胎牛血清、新生牛血清
?白血病抑制因子；干细胞生长因子；牛胰岛素
25
方法
1.
2.
3.
4.
5.胚胎的获得与培养内细胞团的分离干细胞集落的分离干细胞的鉴定统计分析
26
1. 胚胎的获得与培养
?胚胎分别来自体成熟的自然发情或超数排卵的雌性昆明白小鼠，129 品系小鼠（6 周龄）。检到阴道栓的早晨，记为015 dpc。分别于315 和4 dpc ，断颈处死孕鼠，取出子宫，用含5%NBS的PBS 液从子宫角冲胚胎。
27
?在解剖镜下，把冲洗后的胚胎转移到铺有饲养层的培养板中，分别采用3 种不同培养液，即培养液1 : DMEM 液+ 10% NBS + 10% FCS培养液2 : 培养液1 + 1000 IU/ml IF
培养液3 : 培养液1 + 10 mg/ml 胰岛素
37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每天观察1 次，加、换液1 次，记录有关胚胎贴壁、内细胞团（inner cell mass, ICM）出现等生长情况。
28
2. 内细胞团的分离
?胚胎接种到有饲养层的培养板中培养4～5 d 后，内细胞群（ICM ）长大，出现卵圆柱状或岛状形态，周围滋胚层细胞明显展开，此时应分离ICM。
29全能细胞
30
?2+弃去原培养液，加入无Ca2+、Mg的PBS 液洗1 次。在解剖镜下剥去ICM 周围的滋胚层细胞，用吸管把ICM 转移到干净的培养皿中。加一滴胰酶于ICM 上，37℃，消化3 min。
?将ICM 转移到新的培养液中，用吸管吹打将其打散。把打散的细胞接种到有新鲜饲养层的培养板中，在37℃、5% CO2培养箱中继续培养。
31
3. 干细胞集落的分离
?分散的ICM 细胞培养3～7 d 后，在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。
?此时形成的干细胞集落为F1 代，在解剖镜下将F1 代干细胞集落挑出，按照ICM 分离法离F1代干细胞集落，再获得的干细胞集落称为F2 代，将F2 代干细胞集落挑出，再进行分离传代数次，直至获得纯净的ES 细胞集落。
32
4. 干细胞的鉴定
?形态
?AKP （碱性磷酸酶）染色
33
34
(1) 形态鉴定：
典型的'干细胞
?体积较小，有一个大核和少量的细胞质。核中有一个或二个明显的核仁黑色结构。?细胞紧密成群，细胞界限不易区分。?在集落的边缘区域可以看到清晰的单个细胞。
35
(2) AKP 染色鉴定：
?将待测细胞用含7.5%蔗糖的1%多聚甲醛固定，?底物buffer（100 M Tris-HCl pH9.5，50 mmol/l NaCl MgCl2，0.11% Tween-20）平衡，室温避光染色：75 mg/ml nitroblue tetrazolium (NBT，硝基蓝四氮唑) 溶于70% dimethyl-formamide (DMF) ，50 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-in-dolyphophate toluidinium salt (BCIP) 溶于100%DMF ，染色前分别取45 μl 、35 μl 溶于10 ml 底物buffer 中，新鲜配制。ES ( PGC、EG) AKP 染色被染为深蓝紫色，饲养层细胞、分化细
36胞不着色。
5. 统计分析
?SPSS
?Origin
37
诱导多能干细胞（
Induced pluripotent stem cells, iPS cells
）
11月20日，《细胞》和《科学》杂志几乎同时发表了来自日本京都大学的山中伸弥（ShinyaYamanaka）团队和美国威斯康星大学的詹姆斯・汤姆森（JamesThomson）/俞君英团队，通过插入四个特定基因，第一次成功地将普普通通的人体38皮肤细胞，直接改造为功能与胚胎干细胞类似的诱导多能干细胞（iPS）
iPS干细胞建立的过程主要包括：
1.分离和培养宿主细胞
2.通过病毒介导或者其他的方式将若干多个多能性相关的基因导入宿主细胞
3.将导入相关基因的细胞种植于饲养层细胞上，并于胚胎干细胞（Embryonic Stem cell，ES 细胞）专用培养体系中培养，同时在培养中根据需要加入相应的小分子物质以促进重编程
4.出现ES样克隆后进行iPS干细胞的鉴定（细胞形态、表观遗传学、体外分化潜能等方面）
39
iPS干细胞的应用
?在基础研究方面
它的出现，已经让人们对多能性的调控机制有了突破性的新认识细胞重编程是一个复杂的过程，除了受细胞内因子调控外，还受到细胞外信号通路的调控。对于Oct4、Sox2和Nanog等维持于细胞自我新能力的转录因子的研究正在逐渐地展开；利用iPS干细胞作为实验模型，只操纵几个因子的表达，这更会大大加速对多能性调控机理的深入研究。
?在实际应用方面
iPS干细胞的获得方法相对简单和稳定，不需要使用卵细胞或者胚胎。这在技术上和伦理上都比其他方法更有优势，iPS干细胞的建立进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离，iPS干细胞在细胞替代性治疗以及发病机理的研究、新药筛选方面具有巨大的潜在价值。此外，iPS干细胞在神经系统疾病、心血管疾病等方面的作用也日益呈现，iPS干细胞在体外已成功地被分化为神经元细胞、神经胶质细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等。在临床40疾病治疗中具有巨大应用价值。
Kyoto team generates kidney tissue from iPS cells间介中胚层（intermediate
mesoderm，IM）是位于轴旁中胚层
和侧中胚层之间的中胚层组织，可
分化为肾脏的主要器官，Osr1是IM
特异性的标志蛋白。该研究首先通
过同源重组的方式，构建Osr1-GFP
human induced pluripotent stem
cells (hiPSCs) 报告细胞。利用四
种方法诱导iPS细胞分化成IM细胞，
并通过Osr1-GFP进行追踪。从大鼠
胚胎内取出的肾脏细胞与IM混合培
养，最终成长为具有管状结构的组
织。该研究显示，利用iPS细胞可以
诱导分化成立体的肾脏器官
1. Generation of OSR1-GFP knock-in hiPSC lines
?首先将含有OSR1的BAC载
体转入E. coli 中
?之后将OSR1部分编码区替
换成EGFP和PGK-Neo
cassettes，再用Cre重组酶
将PGK-Neo去除，完成基
因的敲入
?用选择性培养基筛选已选
中的细胞。最后获得OSR1-
GFP敲入的hiPSC细胞
42
2. Establishment of robust induction methods
of IM cells
43
?EB（embryoid body）method
a)
b)
c)当hiPSC细胞浓度达到80%时（10-cm的培养皿），用PBS冲洗细胞，在DMEM中加入1 mg/ml胶原酶IV，培养细胞10min 。用PBS冲洗细胞，换成stage1培养基对细胞进行培养（DMEM/ F12 +Glutamax ，500 U/ml双抗，2%FBS)将细胞接种到六孔板中，培养基为stage1，并添加100ng/ml 激活素A 和100ng/ml Wnt3a或1C3 mM CHIR99021。培养三天后将细胞转移至明胶培养皿上，培养20天。采用stage 2培养基（DMEM/F12 +Glutamax，0.1 mM 非必需氨基酸，500 U/ ml双抗，0.55 mM 疏基乙醇，10% KSR，100 ng /ml，BMP7 (R&D Systems) ，100 ng Wnt3a 或1C3 mM CHIR99021）。
?Colony method
a)
b)将生长在mouse embryonic ?broblasts (MEF) 培养层上hiPSC细胞分离出来（CKT溶液），在明胶培养皿中培养30min，去除MEFs，之后将细胞接种于人工基底膜培养皿中于ES培养基中进行培养。当细胞密度达到70%，按照EB method 的方法完成stage1，stage2的操作。
?Single-cell method
a)
b)hiPSC同样生长在MEF上，按照上述方法去除MEFs，用Accutase消化细胞使hiPSC形成单个细胞将细胞种于Collagen Type I-coated 培养皿中，按照按照EB method 的方法完成stage1，stage2的操作，其中在stage1培养过程中额外加入10 mM Y27,632
?Serum-free-cell method
采用无血清培养基DMEM/ F12 +Glutamax ，500 U/ml双抗，1×B27，其他步骤同Single-cell method
44
3. Characterization of developmental potential of
human IM cell
?hiPSC分化的
于24孔板中，用stage2的培养基并添加10 mM Y27,632 和10 ng/ml TGFβ1培养7天。
?从ICE小鼠的第11.5天的胚胎中取出后肾组织，之后用0.05%胰酶-EDTA 37℃作用10 min，用肾培养基进行培养10min ，然后过滤。
?10×104后肾细胞与之前处理的1×104 OSR1(GFP)+细胞混合接种于96孔板中。加入10 mM Y27,632，37℃过夜培养，形成聚合体。器官培养一周后，聚合体逐渐稳固。
45+OSR1(GFP)细胞培养11天后，接种
利用病人尿液细胞获得神经干细胞通过转染携带表达干细胞因子基因的载体的方式将一些干细胞因子导入从病人尿液中分离而来的细胞中并通过特殊的诱导培养基培养，成功地将病人的尿液细胞诱导转变为具有功能的神经干细胞。这些由尿液细胞转变而来的神经干细胞能够在体外扩增并在适当的条件下分化成熟为人体中各种存在的神经元和角质细胞。在进一步的动物模型的移植实验中，能够很好的在46
Nature Methods 10: 84C89 (2013)
1. Isolation and culture ofHuman urine cells(HUCs)取中段尿500ml离心，获得细胞，用尿液细胞培养基（1:1 DMEM/F12 培养基，10% FBS，0.1 mM 非必需氨基酸, 1 mM GlutaMAX，0.1 mM β-疏基乙醇）进行培养。
2. Generation of integration-free
nPcs from human urine cells
a)包含OCT4，SOX2，KLF4 和SV40LT基因的
oriP/EBNA1-based pCEP4 载体与含有miR302C
367 precursor的pCEP4 载体共转染到HUCs。
b)将共转染后的HUCs接种到人工基底膜包被的6孔
板中，用尿液细胞培养基进行培养。
c)第二天换成mTeSR 或5i培养，每两天换一次液，
15天之后，从5i中挑选克隆并于新的人工基底膜包
被的培养皿中进行培养。
d)将细胞分离成单个细胞并用神经细胞的培养液进
行培养。
47
3. Neural differentiation in vitroa)pan-neuronal分化
hUiNPCs 单细胞接种到人工基底膜包被的培养皿中，用神经细胞培养液N2B27并且加入EGF 和bFGF，神经营养因子BDNF，GDNF，CNTF，IGF1（10 ng/m)，1 ?M cAMP，细胞分化两周后，通过检测不同神经细胞的不同标记蛋白来检测分化情况b) 树突细胞的分化
hUiNPCs 种于poly-l-ornithine/laminin基底上，用DMEM/F12 培养基并添加1% N1，biotin (100 ng/ml)，PDGF-AA (20 ng/ml)，NT3 (20 ng/ml), 1 ?M cAMP and bFGF (10 ng/ml) 培养一周。之后三周的培养用IGF1替换bFGF 48
Tumor cell
49
肿瘤细胞的培养
50
篇10：TCB4-1细胞培养技术+-2-
1
Outline
1.
2.
3.
4.Animal cell cultureHuman cell cultureStem cell cultureTumor cell culture
2
Deng XB, et al., Apoptosis. 201143
Animal cell culture
?Primary culture
Sensitive
Complex
?Cell line
ATCC (American Type Culture Collection)
4
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