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山羊毛囊干细胞分离培养方法研究

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山羊毛囊干细胞分离培养方法研究

篇1：山羊毛囊干细胞分离培养方法研究

山羊毛囊干细胞分离培养方法研究

分别采用组织块法和酶消化法分离培养山羊毛囊干细胞,并通过形态学观察、免疫组化染色以及克隆形成率来比较2种方法体外分离培养毛囊干细胞的效率.组织块法获得的细胞第1、3、7代K19阳性率分别为52.0%±1.62%、68.4%±1.82%、72.0%±2.42%,mtegrin-β1分别为52.5%±2.12%、66.3%±1.98%、73.0%±2.16%,而消化法获得的`细胞第1、3、7代K19阳性率分别为56.2%±3.12%、61.7%±1.17%、64.0%±3.02%,integrin-β1分别为56.0%±1.12%、63.0%±1.12%、68.0%±2.32%;组织块法获得的细胞第1、3、7代克隆形成率分别为18.4%±0.77%、31.3%±0.88%、44.7%±1.03%,而消化法获得细胞第1、3、7代克隆形成率为22.6%±2.30%、26.9%±0.86%、32.8%±1.05%;在同样培养条件下,组织块法获得的细胞可体外传19代,而消化法可传12代.结果表明两种方法均能分离得到毛囊干细胞并进行传代,但随着传代次数的增加,组织块法获得的细胞免疫组化染色阳性率、克隆形成率以及传代能力均显著高于酶消化法获得的细胞(P＜0.01).

作者：史明艳杨学义窦忠英 SHI Ming-yan YANG Xue-yi Dou Zhong-ying 作者单位：西北农林科技大学国家干细胞工程技术研究中心陕西分中心,杨凌,712100 刊名：畜牧兽医学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA 年，卷(期)： 37(5) 分类号：Q813 关键词：山羊毛囊干细胞组织块酶消化克隆形成率

篇2：分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞的方法探析论文

分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞的方法探析论文

骨髓间充质干细胞（BMSCs）也被称为间质祖细胞，由于其巨大的增殖和多向分化潜能，被认为是再生医学、基因治疗和细胞治疗的理想种子来源，已被广泛进行研究[1-3].目前，BMSCs在动物实验和临床应用上取得了巨大的成果，在骨、软骨、肌腱、神经胶质修复、心脏疾病、心肌梗塞、肝脏损伤等方面取得了重大突破[4-6],并且可避免胚胎干细胞和异基因干细胞治疗所涉及的伦理道德和免疫排斥问题，有利于细胞移植。但是骨髓中的BMSCs含量极少，约占骨髓全细胞的0.001%~0.010%[7];因此，需要在体外分离纯化、培养扩增来满足临床应用和实验研究。研究表明，不同分离方法和首次换液方式对BMSCs的增殖培养有很大的影响[8].本试验通过观察2种不同分离方法和不同首次换液时间对兔BMSCs生物活性的影响，旨在建立一种有效的分离培养及鉴定BMSCs的方法，以便获得大量、高纯度、高活性、培养周期短的BMSCs,为下一步研究和临床实验提供基础。

1 材料与方法

1.1实验动物1月龄雄性新西兰大耳白兔1只，由河南省实验动物中心提供。

1.2主要试剂和仪器胎牛血清（北京四季青）；DMEM-F12（Gibco）；胰蛋白酶（北京拜尔迪生物公司）；DMSO（Gibco）；红细胞裂解液（北京赛驰生物技术有限公司）；生物素标记山羊抗兔IgG、HRP标记链霉亲和素、DAB显色试剂盒、改良型苏木素（北京华肽先锋）；兔抗兔CD34、CD44、CD99抗体（北京博奥森）；封闭山羊血清（北京博奥森）。

HF151UV型CO2培养箱（Heal Force）；倒置显微镜（Leica）;800型离心机、85-2恒温磁力搅拌器：金坛市大地自动化仪器厂；数码相机：日本佳能IXUS 980IS;电子天平：METTLER TOLEDO AL104;超净工作台：AIR TECH;FX101-2型电热鼓风干燥箱：上海树立仪器仪表有限公司；pH计：上海雷磁仪器厂。

1.3 BMSCs的提取用陆眠宁（846）将1月龄新西兰大耳白兔麻醉，腿部去毛消毒，无菌条件下分离股骨、胫骨，剔除脂肪和肌肉，PBS液反复冲洗，剪断两侧干骺端，尽量多保留干骺端，DMEM-F12培养液反复冲洗骨髓腔于A、B两个10mL的离心管内，直至骨髓腔发白，1 000r/min离心5min,弃上清。

1.4全骨髓贴壁法A管用PBS重悬细胞，1 000r/min离心5min洗涤2次，弃上清。吸取3mL含10%FBS的DMEM-F12（1∶100双抗）培养液重悬细胞，接种至3个25cm2培养瓶，补足培养液至5mL,轻柔吹打均匀。置于37℃、5%CO2条件下培养。以后每3d换液1次，待细胞生长融合至80%时传代培养。先弃去旧培养液，PBS液浸洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃条件下孵育3min,含血清的DMEM-F12终止消化。以1∶2的比例传代培养，每3d换液1次。每天在倒置显微镜下观察细胞形态。

1.5红细胞裂解法B管加入1mL红细胞裂解液重悬细胞，静置1~3min,待液体由红色变为白色后，加入5 mL PBS液，1 000r/min离心2次，5min/次，弃上清。吸取3 mL含10% FBS的DMEM-F12（1∶100双抗）培养液重悬细胞，接种至3个25cm2培养瓶，补足培养液至5mL,轻柔吹打均匀。置于37℃、5%CO2条件下培养。

2d后首次换液，以后每3d换液1次，待细胞生长融合至80%时传代培养。先弃去旧培养液，PBS液浸洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃条件下孵育3min,含血清的DMEM-F12终止消化。以1∶2的比例传代培养，每3d换液1次。每天倒置显微镜下观察细胞形态。

1.6兔BMSCs细胞活性检测及生长曲线绘制培养48h时，各取一瓶细胞，弃去培养基，用PBS冲洗2遍，倒置显微镜下观察细胞。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化后，0.4%台盼蓝染色，血球计数板计数活细胞（未着色）和死细胞（着色细胞）。分别计算出2种不同分离方法的细胞活性。上述试验重复3次。

选取生长良好的P1、P3和P8代细胞，以2.0×104个/孔，接种于24孔培养板中，每孔1mL,每3d换液1次，每隔1d取3孔，消化后计数，取其平均值为当天的细胞数，连测8d,以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.7首次换液时间对兔BMSCs的影响将用红细胞裂解法分离得到的兔BMSCs按首次换液时间随机分为4组：12h换液组、24h换液组、48h换液组、72h换液组，以后每3d换液1次，记录传代前各组0~3代各代培养时间，各代细胞均保留3瓶。

1.8细胞免疫组化鉴定兔BMSCs收集红细胞裂解法的P3代细胞，制备细胞爬片，常规SABC免疫组织化学方法检测表面抗原CD34、CD、CD45、CD90的表达。

1.9统计学处理所得数据以均数±标准误表示，应用SPSS16.0统计学软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），用Microsoft Excel软件作图。

2 结果

2.1不同分离方法对兔BMSCs形态和生长的影响

刚接种时，2种不同分离方法所得的原代细胞在倒置显微镜下观察细胞呈圆形，大小一致，折光性强，不容易区分。培养48h后，A、B两组细胞均可看见有圆形、短梭形、多角形细胞贴壁。

B组贴壁细胞较A组细胞多（图1）。台盼蓝染色检测细胞活性全骨髓贴壁法（A组）为90%,红细胞裂解法（B组）为96%.随着培养的继续，大量细胞贴壁，并出现典型的BMSCs细胞集落，紧密排列。

A组细胞生长较缓慢，所得细胞纯度较低；B组细胞生长较快，纯度较高。原代细胞达到传代的时间A组为10.2d,B组为7.2d,差异显着（P<0.05）。B组细胞P3代细胞呈旋涡状或放射状生长，细胞形态大小均一（图2）.

2.2兔BMSCs生长曲线绘制

通过细胞计数法绘制细胞生长曲线，对兔BMSCs的生长特性进行鉴定。结果显示，P1、P3、P8代细胞培养过程中，细胞生长具有相似的特点：1~2d细胞处于潜伏期；3~6d细胞处于对数生长期；6~8d生长逐渐减慢，开始进入平台期（图3）。传代细胞生长相对稳定，随着传代次数的增加，细胞会出现衰老的特征，增殖速度减慢。

2.3兔BMSCs的鉴定

结果显示，CD44、CD90抗原表达阳性，CD34抗原表达阴性（图4），符合BM-SCs表面分子标记特征。

2.4首次换液时间对兔BMSCs培养周期的影响红细胞裂解法分离兔BMSCs,分别在12,24,48,72h首次换液，结果（表1）显示，24h换液组P0、P1、P2、P3代以及总时间的'细胞培养时间与其他各组比较差异极显着（P<0.01），表明24h首次换液可缩短细胞培养周期。

3 讨论

骨髓中BMSCs的含量很低，一般为0.001%~0.010%,其数量和生长能力与年龄呈显着负相关，想要在临床实践中利用BMSCs,就必须实现其在体外的分离培养和扩增。目前，常用的BMSCs的分离和纯化方法有：全骨髓贴壁法、红细胞裂解法、密度梯度法、免疫磁珠分选法和流式细胞术分选法，后2种方法筛选BMSCs的分选效率和纯度均较高，但是对实验条件和设备要求较高，费用昂贵，并且BMSCs表面缺乏特异性标志，在具体操作过程中可造成细胞的损伤和死亡，所以较少使用[9].密度梯度法由于分离液往往对BMSCs有一定的损伤，且离心会丢失大量的细胞，对细胞活性有影响，因此应用受到很大限制[10].本试验通过比较全骨髓贴壁法和红细胞裂解法，发现2种分离方法均可得到较均一的长梭形细胞，聚集成旋涡状均匀生长。但是红细胞裂解法分离得到的BMSCs在48h时贴壁细胞显着多于全骨髓贴壁法，并且细胞活性较高，细胞密度达到80%融合，首次传代时间也较短。这可能是因为全骨髓贴壁分离法保留了造血干细胞和其他杂细胞，在体外培养过程中混杂的细胞会对BMSCs的生长及贴壁产生影响，所得BMSCs纯度和细胞活性均较低；而红细胞裂解液的有效成分是氯化铵，能够利用红细胞的渗透脆性特异性的破坏无核红细胞膜而去除红细胞和血小板，并且对有核细胞无影响，从而去除骨髓中含量最高的细胞成分，经红细胞裂解液处理后，减小了杂细胞对其贴壁的影响，为BMSCs贴壁保留了空间，有利于BMSCs的早期贴壁[11],所得细胞纯度高，且细胞活力不受影响。因此，利用红细胞裂解法，能够在较短的时间里获得大量的高纯度、高活性的目的细胞，是一种有效的分离纯化BMSCs的方法。

有研究表明，首次换液时间对BMSCs的生殖增长有一定的影响。原代首次换液时间过早，由于骨髓冲洗液中其他细胞分泌滋养BMSCs的生长因子等多种有益成分丢失，贴壁细胞数量减少，细胞生长缓慢，细胞培养周期延长；原代首次换液时间过晚，杂质贴壁紧密，细胞代谢产物等有害成分增多，造血干细胞分泌的生长因子使BMSCs出现分化等，从而导致细胞增殖周期延长。本试验分别在12,24,48,72h首次换液，24h换液组，首次传代时间及细胞培养总周期与其他各组比较，差异有显着性意义，能显着缩短细胞培养时间，因此，培养24h首次换液为最佳首次换液时间。

BMSC目前还没有发现特异性的表面标记物，其鉴定尚无统一标准。

BMSC的表面抗原具有非专一性，表达内皮细胞、间质细胞、表皮细胞和肌肉细胞的表面标志，它包括（1）粘附分子CD44、CD105、CD166、CD54、CD102等；（2）整合素家族成员CD29、CD104、CD49a等；（3）其他CD90等[12-14].不表达造血干细胞表面标志，如CD34、CD45、CD11b、CD11a等[15-16].BMSCs,结果显示，BMSCs阳性表达CD90和CD44,造血干细胞标志CD34呈阴性表达，符合BMSCs的表面标志物特征，证实我们体外分离培养的细胞为纯化的BMSCs.

综上所述，通过红细胞裂解液法分离得到的兔BMSCs生长增殖旺盛，生物学性状稳定，于培养24h首次换液可显着缩短细胞的培养周期，便于后续的试验研究。

篇3：成体狗骨髓间充质干细胞的分离和体外培养的初步研究

成体狗骨髓间充质干细胞的分离和体外培养的初步研究

目的探索成体狗骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、体外培养,为其将来应用提供实验依据.方法无菌条件下抽取狗肋骨骨髓,Ficoll分离液(密度1.077g/ml)梯度离心分离单个核细胞,在含10%新生牛血清的DMEM中,37℃、5%CO2、饱和湿度下常规培养,取贴壁细胞并进行传代,观察细胞的生长形态.结果取得较高纯度的成体狗骨髓MSCs,并保持细胞的活性;成体狗骨髓MSCs在体外培养中,为贴壁生长的单个核球形细胞,培养3～4d后开始大量增殖,为纺锤形和星形多突起的细胞贴壁生长,6～8d细胞达到70%～90%融合.传代细胞3～4d即可再次传代.结论采用Ficoll分离液进行梯度离心分离,可获较高纯度的MSCs,是实用、便捷和可行的.方法 ;而且在体外培养的条件下能大量增殖,形成形态均一的细胞集落,可以成为进一步进行细胞扩增或其它实际应用的基础.

作者：雷开键杜一平姜雄熊永祥贾钰铭宋玉光林萍罗华作者单位：宜宾市第二人民医院肿瘤科,四川,宜宾,644000 刊名：四川医学 ISTIC英文刊名：SICHUAN MEDICAL JOURNAL 年，卷(期)： 28(10) 分类号：Q813.1 关键词：间充质干细胞细胞培养体外骨髓狗

篇4：大鼠骨髓间充质干细胞分离与培养条件的优化研究

大鼠骨髓间充质干细胞分离与培养条件的优化研究

目的:建立和优化大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的.分离培养条件,以获得群体均一、未分化状态保持良好的MSCs.方法:收集不同周龄大鼠骨髓细胞;以不同浓度Percoll密度梯度离心分离骨髓单个核细胞;以60%低糖DMEM40%MCDB201为基础培养基,培养24h去悬浮细胞;以不同接种密度传代培养;碱性磷酸酶染色和油红O染色考察MSCs向骨和脂肪组织分化的潜能.结果:采用57%Percoll液的分离效果优于70%Percoll液.6周龄(体重约180g)大鼠能在细胞分离的质和量上达到最佳效果.24h进行悬浮细胞去除、5×103/cm2接种密度传代培养,光镜和电镜显示MSCs增殖能力强,功能状态活跃,成脂成骨实验显示多向分化潜能保持良好.结论:优化大鼠周龄、分离液的密度、细胞培养条件及改进培养方法有助于获得多向分化潜能保持良好的均一的MSCs.

作者：晏丹舒赛男 YAN Dan SHU Sai-nan 作者单位：晏丹,YAN Dan(武汉科技大学医学院病理教研室,湖北,武汉,430065)

舒赛男,SHU Sai-nan(华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科,湖北,武汉,430030)

刊名：现代生物医学进展 ISTIC英文刊名：PROGRESS IN MODERN BIOMEDICINE 年，卷(期)： 8(1) 分类号：Q813.1 关键词：间充质干细胞分离培养优化

篇5：胶质母细胞瘤肿瘤干细胞体外分离培养鉴定及生物学特性的研究

胶质母细胞瘤肿瘤干细胞体外分离培养鉴定及生物学特性的研究

目的:探讨人脑胶质母细胞瘤(GBM)肿瘤干细胞的`培养方法,观察其体外增殖、分化等生物学特性.方法:应用改良神经干细胞培养基,11例人脑GBM标本中悬浮培养GBM的肿瘤细胞.采用有限稀释法筛选分离具有连续克隆能力的单细胞.通过免疫组化及电镜观察的方法,确定其干细胞特征;通过核型分析探讨该细胞的肿瘤性质;将确定的脑肿瘤干细胞(BTSCs)接种于不含生长因子的干细胞培养基,观察其在体外条件下分化的特点.结果:本组样本中10例(1例污染)获得具有连续克隆和增殖能力及干细胞特征的肿瘤细胞.结论:人脑GBM中存在具有自我更新和增殖潜能的BTSCs,在体外可将其分离、培养和纯化.

作者：车晓明崔大明汪洋施炜刘天津王柯 CHE Xiao-Ming CUI Da-Ming WANG Yang SHI Wei LIU Tian-Jing WANG Ke 作者单位：车晓明,崔大明,施炜,王柯,CHE Xiao-Ming,CUI Da-Ming,SHI Wei,WANG Ke(复旦大学附属华山医院神经外科,40)

汪洋,WANG Yang(复旦大学上海医学院解剖组胚学系,200032)

刘天津,LIU Tian-Jing(中国科学院细胞所,200032)

刊名：中国临床神经科学 ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CLINICAL NEUROSCIENCES 年，卷(期)： 15(6) 分类号：Q189 R741 关键词：胶质母细胞瘤脑肿瘤干细胞神经干细胞悬浮培养无血清培养基

篇6：大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

为了确定大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)体外分离和培养的方法,建立了稳定的MSCs体外培养扩增体系,通过密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs,观察了细胞的形态,研究了其增殖及生长特征,并应用流式细胞术测定了细胞周期及CD29,CD44,CD45和HLA-DR的.表达.结果表明,在体外培养条件下大鼠MSCs贴壁生长,为成纤维细胞样;CD45和HLA-DR的表达呈阴性,CD29和CD44的表达呈阳性;细胞周期的G0/G1期约占95%,具有原始细胞的特征.说明建立的体外培养扩增体系可获得形态单一、生长稳定、增殖性较强、较均一的大鼠MSCs.

作者：李延清刘霞 LI Yan-qing LIU Xia 作者单位：李延清,LI Yan-qing(延安大学,生命科学学院,陕西,延安,716000)

刘霞,LIU Xia(延安大学,生命科学学院,陕西,延安,716000;西北农林科技大学,动物科技学院,陕西,杨凌,712100)

刊名：西北农林科技大学学报（自然科学版） ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF NORTHWEST SCI-TECH UNIVERSITY OF AGRICULTURE AND FORESTRY(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)： 34(5) 分类号：Q813.1+1 关键词：大鼠骨髓间充质干细胞细胞形态细胞周期密度梯度离心流式细胞术

篇7：山羊子宫内膜腺上皮细胞的分离培养和鉴定

山羊子宫内膜腺上皮细胞的分离培养和鉴定

为了探讨山羊子宫内膜腺上皮细胞的`分离、生长条件以及纯度鉴定,通过2 g/L的Ⅰ型胶原酶置于水浴消化4 h,200目的滤网过滤后进行低速离心,收集沉淀物,沉降洗涤3～5次,将细胞移至24孔培养板置37℃细胞培养箱中进行培养.12 h后开始贴壁生长,腺团开始向外部扩散,生长2～3 d,细胞扩散并出现明显的铺路石状,4～5 d腺团基本扩散开来并呈一定走向继续生长.经免疫组织化学方法进行细胞染色,细胞表达角蛋白的阳性率达90%以上.

作者：丰艳妮吴庆侠吴瑞楚元奎靳亚平FENG Yan-ni WU Qing-xia WU Rui CHU Yuan-kui JIN Ya-ping 作者单位：农业部家畜生殖内分泌与胚胎工程重点开放实验室,西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌,712100 刊名：西北农业学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA AGRICULTURAE BOREALI-OCCIDENTALIS SINICA 年，卷(期)：2006 15(6) 分类号：S827 关键词：子宫内膜腺上皮细胞免疫组织化学鉴定

篇8：不同类型血清对大鼠脂肪干细胞分离培养的影响

不同类型血清对大鼠脂肪干细胞分离培养的影响

目的研究不同血清培养基对脂肪干细胞分离培养的影响.方法用4种不同类型的`血清培养基分离培养大鼠脂肪干细胞,免疫荧光法检测培养细胞CD34、CD90、CD133、Flk-1表面标志;成骨诱导液诱导分化,于14 d进行碱性磷酸酶和钙染色检验各细胞成骨分化特性.结果 (1)新生牛血清组可见贴壁单个核细胞形态单一,呈梭形生长,无重叠现象;胎牛血清组均可见大量多角细胞呈巢状生长,形成铺路石样形态,间或有梭形细胞存在; (2)新生牛血清组梭形贴壁细胞免疫荧光检测可见CD90为阳性,CD34、CD133、Flk-1染色均为阴性;胎牛血清组多角形细胞CD34、Flk-1均为阳性,CD133组部分为阳性,CD90为阴性; (3)新生牛血清组贴壁细胞多数呈碱性磷酸酶阳性;胎牛血清组细胞多角状细胞死亡,形成空白区,梭形细胞呈碱性磷酸酶阳性; (4)新生牛血清组均可见大量红色钙结节影;胎牛血清组细胞多角状细胞死亡,形成空白区,梭形细胞红色钙结节影.结论 (1)新生牛血清培养脂肪干细胞可以得到较纯的细胞; (2)胎牛血清组培养含有大量的血管内皮细胞.

作者：王福科赵德萍代晓明李逸松何晓光刘流作者单位：王福科,代晓明,李逸松,何晓光,刘流(昆明医学院第一附属医院头颈外科,云南昆明,650031)

赵德萍(昆明医学院第一附属医院实验中心,云南昆明,650031)

刊名：昆明医学院学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF KUNMING MEDICAL UNIVERSITY 年，卷(期)： 31(3) 分类号：Q813.1 关键词：脂肪干细胞免疫荧光血清血管内皮细胞

篇9：恶性胶质瘤细胞株U251中肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定

恶性胶质瘤细胞株U251中肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定

目的:从恶性胶质瘤细胞株U251中分离、培养并鉴定肿瘤干细胞.方法:将U251细胞置于含EGF、bFGF、LIF及B27的`无血清培养基中培养,形成悬浮生长的细胞球后经免疫磁珠分离获取CD133阳性细胞,采用单细胞克隆法继续在上述培养液中培养.应用细胞免疫荧光染色对肿瘤干细胞及其分化细胞进行鉴定.结果:在恶性胶质瘤细胞株U251中成功分离出肿瘤干细胞,在上述无血清培养液中呈悬浮生长,具有很强的自我更新与繁殖能力,免疫荧光染色显示该细胞表达CD133,诱导分化后可分化成为神经元与星形胶质细胞.结论:体外培养的恶性胶质瘤细胞株U251中存在脑肿瘤干细胞,并能将其分离、培养及诱导分化.

作者：王彬杨辉尹昌林吕胜青刘海鹏 WANG Bin YANG Hui YIN Chang-Lin LU Sheng-Qing LIU Hai-Peng 作者单位：第三军医大学附属新桥医院神经外科,400037 刊名：中国临床神经科学 ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CLINICAL NEUROSCIENCES 年，卷(期)：2007 15(6) 分类号：Q198 关键词：胶质瘤脑肿瘤干细胞培养免疫磁珠