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喉部细菌的检查的实验材料

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喉部细菌的检查的实验材料

篇1：光合细菌改善养鱼水环境实验论文

光合细菌改善养鱼水环境实验论文

光合细菌（PSB）具有改善水质，促进养殖鱼类机体新陈代谢的作用，可作为改良水质微生物制剂及鱼类的饵料和饵料添加剂，具有降低氨氮、亚硝酸氮、硫化氢、残饵及鱼类粪便的污染、净化池塘底质、维持水质清新、增加水体溶氧等特点；且其大量繁殖能带动许多其他有益微生物的繁衍从而抑制有害细菌滋生和有害藻类的繁殖，为鱼类提供营养丰富的天然饵料。同时可提高鱼类的免疫功能，增强抗病力，减少鱼类病害发生［1］。在养殖生产实践中表现在降低饵料系数、促进鱼类快速生长、提高鱼类成活率和单位面积产量等方面。为此，国家大宗淡水鱼类产业技术体系贵阳综合试验站与贵州省水产研究所和黔东南州水产实验场，结合贵州渔业生产中的高效新型池塘养殖模式及底质改良需求实际，承担贵州省科技术厅科技支撑项目，于2011年进行光合细菌改良池塘水环境养鲤试验，旨在为养鱼池塘水环境和底质改良提供科学依据。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1鱼池

试验池（3号塘）1口，面积750m2，对照池（14号塘）1口，面积1 200m2。

1．1．2光合细菌

为国家大宗淡水鱼类产业技术体系贵阳综合试验站调进的冻干光合细菌原粉，含菌数≥100亿／g，10kg／包，产品性状为棕色粉末。

1．1．3鱼种

为贵州省水产研究所从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心调进的福瑞鲤鱼种。

1．1．4水源

来源于贵州凯里洗马河，水源充足，水质符合国家渔业水域水质标准，通过50m长的引水沟渠自流灌注入鱼塘。

1．1．5饲料和药物制剂

为重庆通威饲料有限公司生产的鲤鱼专用配合颗粒饲料。备齐在试验过程中所需的光合细菌等微生物制剂、鱼类养殖所需的生产工具和鱼病防治所需的药物。

1．2方法

1．2．1鱼池准备

鱼种放养前8～10d，用生石灰20kg／100m2消毒池塘。清塘4～5d后灌注池水40～50cm深，同时施腐熟猪粪200kg／667m2培肥水质。

1．2．2鱼苗培育

2011年5月3日从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心调进福瑞鲤乌仔鱼苗30万尾。投放鱼苗入池后，每天投喂豆浆（黄豆用20℃水浸泡10～12h，1kg黄豆带水磨成20kg）2次，时间为8：00～9：00、15：00～16：00，全池均匀泼洒，黄豆用量2～3kg／667m2；待鱼苗培育至1．5～2cm规格，逐渐训食人工饲料，经过40d培育，鱼苗规格达4～5cm即可分池下塘。

1．2．3鱼种投放

2011年7月6日把规格达8g／尾的福瑞鲤鱼种，按400尾／100m2的放养密度放入3号试验塘，总投放鱼种3 000尾，重24kg；14号对照塘投放福瑞鲤鱼种规格为8．5g／尾，总投放鱼种5 000尾，重42．5kg。鱼种入池前用浓度为10mg／L的高锰酸钾药液浸浴鱼体5～10min。

1．2．4饲料投喂

1）确定投饵量。测定池塘水温和塘鱼规格，并根据鲤鱼饲料投饵率表计算投饵量，当水温20～28℃时日投饵量为鱼体重的1．50％～5．00％。2）投饵方法。一是定时投喂：在鱼类摄食正常时日投喂4次，投饵时间为8：00、11：00、15：00和18：00；二是定点投喂：投饵区域设在鱼池前部1／2～1／4处。

1．2．5池塘日常管理

一是加强日常池塘巡查管理，根据池塘水质、鱼类活动情况、水温及气温变化等适时注入新水，使池水的水质清新、溶解氧含量高且水位适宜，以利于鱼类生长；二是每间隔15～20d测定池鱼平均体重1次，以此确定投饵量；三是加强鱼病防治，用大蒜配制药饵投喂，按100kg饲料添加大蒜3～5kg，将大蒜捣成蒜泥后拌入颗粒饲料中，现配现喂，每天早晚各1次，连喂3～5d为1个疗程，发现鱼病及时诊断治疗。

1．2．6光合细菌泼洒

在晴天的早晨用光合细菌200g按667m2、1m水深溶于水后全池均匀泼洒，每间隔15d泼洒1次。先停止向池塘注入新水，后施光合细菌，并在施微生物制剂期间不使用抗菌素或消毒剂等。

1．2．7池塘水样、泥样采集

一是采集时间：在光合细菌泼洒前采样1次，使用光合细菌后24h采第2次样，第3～7次是每间隔48h采样1次。二是采集地点：3号试验塘投饵点附近、上下风口附近取水面下50cm的混合水样500mL和采集投饵点附近底泥表层下5cm的`混合泥样150～200g。

1．2．8池塘水样预处理

采样当天须对水样预处理，抽滤0．2μm的膜得总细菌，一般视5μm膜以上所得菌为附着菌，0．2～5μm膜所得菌为浮游细菌，每次抽滤前后用蒸馏水冲洗过滤器，所得的膜用蒸馏水洗净，并用擦拭干的镊子取出，放入1．5mL离心管内，作好采样点和时间等记录。滤膜与过滤器配套，聚碳酸酯脂膜抽滤前先将水样摇匀，用量筒量200mL水样用于抽滤，每次抽滤换样时用蒸馏水将量筒洗净。光合细菌改良池塘水环境水质监测数据指标见表1。

2结果与分析

2．1养殖产量

2011年10月8日现场干塘过秤实测3号试验塘产量，收获鲤鱼2855尾，总重819．5kg，扣除投放的鱼种重量24kg，总计净产量795．5kg，单产707．5kg／667m2，比14号对照塘571．4kg／667m2增产136．1kg／667m2，单产提高23．82％（表2）。

2．2生长速度

从表2看出，3号试验塘投放鱼种规格为8g／尾，收获规格为287g／尾，增长279g／尾，增重3g／（尾d），比14号对照塘（2．54g／尾）提高18．11％。3号试验塘个体增重34．9倍，比14号对照塘（27．8倍）提高7．1倍。3号试验塘群体增重32．1倍，比14号对照塘（23．2倍）提高8．9倍。

2．3饵料系数与养殖成活率

从表2可知，3号试验塘的饵料系数为1．63，比14号对照塘（1．85）下降0．22。3号试验塘共投放鱼种3 000尾，收获2 855尾，平均成活率95．16％，比14号对照塘（87．40％）高7．76百分点。

3小结与讨论

3．1光合细菌对鱼类生长速度的影响

淡水资源是基础自然资源，系生态环境建设的控制因素［2］，随着《中国水生生物资源养护行动纲要》的颁发和《农产品质量安全法》的实施，水产品的食用安全和出口产品药残超标问题，已进一步引起我国水产养殖企业的高度重视，全面推广健康、生态养殖技术已是当务之急。由于光合细菌具有降低氨氮、亚净化池塘底质、改良池塘水环境等特点，从而促进鱼类快速生长。试验结果表明，施光合细菌后与对照池（空白组）对比，在促进鱼类生长方面效果明显，3号试验塘鱼的日增重为3g／（尾d），比14号对照塘（2．54g／尾）提高18．11％；3号试验塘个体增重34．9倍，比14号对照塘（27．8倍）提高7．1倍；3号试验塘群体增重32．1倍，比14号对照塘（23．2倍）提高8．9倍。

3．2光合细菌增产效果显著

池塘水环境是鱼类栖息活动的场所，也是鱼类天然饵料生物的生产基地，其好坏直接影响到天然饵料生物的丰欠；施光合细菌能带动许多其他有益微生物的繁衍从而抑制有害细菌和有害藻类的繁殖，为鱼类提供营养丰富的天然饵料。在池塘养鱼中，鱼池底泥有培养底栖生物和调节水质的作用［3］，池塘水质不同于一般的天然淡水，特别是盐度与pH值较高是影响鱼产量的重要因素［4］，光合细菌可改良池塘水环境而大幅度提高单位面积产量。试验结果表明，3号试验塘单位面积净产量达707．5kg／667m2，较14号对照池塘（571．4kg／667m2）提高136．1kg／666．67m2，单位面积产量提高23．82％。

3．3光合细菌可提高鱼类免疫功能和降低饵料系数

光合细菌具有降解水体中氨氮、亚硝酸盐等有毒物质的含量，可分解养殖水体中的残饵和水生动物的排泄物、有机碎屑等，为单细胞藻类提供营养源，培育优质藻类，增加水中溶氧，改善养殖水体环境；定期使用可保持养殖水体的优良水质，提高养殖水体自净能力，抑制有害藻类和致病菌的生长繁殖，增强养殖动物机体抗病能力，减少病害的发生，从而节约养殖成本；可稳定养殖水体中的酸碱度，防止因pH值失衡而导致的水体恶化，产生亚硝酸盐的积累，造成对养殖鱼的危害。只有水质好，疾病就自然少［5］。养殖水体增加足量溶氧、适量氧化剂、氯离子和消化细菌，可降低亚硝酸盐的含量［6］；从而增强鱼类的抗病力，减少发病机会。试验结果表明，使用光合细菌可提高鱼类成活率和降低饵料系数，3号试验塘共投放鱼种3 000尾，收获2855尾，平均成活率95．16％；比14号对照塘（87．4％）高7．76百分点。3号试验塘共投喂饲料1 300kg，净产鱼795．5kg，饵料系数为1．63，比14号对照塘（1．85）下降0．22。

3．4光合细菌可改良池塘沉积物

池塘沉积物是指池塘水体范围内发生的物理、化学及生物学过程所产生的沉降物质，是池塘生态系统的重要组成部分。沉积物的理化性质和细菌状况对整个池塘生态系统有重要的影响，从而影响到养殖鱼类的生长和产量［7－8］。沉积物中有机物含量和氮、磷、钾等营养元素含量比农业土壤中的含量高得多，有机物含量与总氮含量之间存在明显的正相关关系［9］；2011年8月25日通过对3号试验塘光合细菌改良池塘水环境监测数据显示，3号池塘底泥中总氮为2．764mg／L、总磷1．134mg／L、铜31．621mg／L、锌187．06mg／L，分别比14号对照池低0．721mg／L、0．555mg／L、20．242mg／L和86．02mg／L。因此，在生产实际中减少池塘沉积物的对策：一是清除过多淤泥。随着养殖时间的延长，投饵施肥量增加，池塘底部就会沉积鱼类粪便、饲料残渣、有机质等，这些有机物容易滋生致病菌、寄生虫和有毒物质，池塘底质过厚的淤泥不利于鱼类生长，所以要每隔1～2年清淤1次。二是定期搅动池底。搅动池底即是翻松底泥和使池水上下混合，促进池塘底部有机物质分解，释放出淤泥中的有毒物质，保持营养物质在上下水层分布的平衡，每隔15d搅动池底1次。

3．5光合细菌可改善池塘水体中氮循环

细菌在渔业水生态系统中发挥着重要作用，它既是分解者，又是许多鱼类直接或间接的饵料。所以，监测池塘水环境的细菌状况将有助于充分认识细菌在池塘物质转化、鱼类饵料等多方面的功用，完善池塘营养结构研究的理论，并对在养殖生产中进行合理放养、科学管理、发挥细菌更大生态效能、提高产鱼潜力具有重要指导意义［10］。在自然水体中氮循环是一个相当完全的、具有自我调节和反馈机制的系统，一方面它是鱼类等养殖对象的重要营养成分，另一方面其表现形式中氨（NH3）和亚硝酸盐（NO2）积累到一定程度对鱼类产生明显的毒性影响，氮也是引起水体富营养化的重要因子。人工养殖水体中氮循环原有的稳定状态是否受到影响已日益受到人们的关注。人工养殖主要依靠人工投饵促进鱼类生长、提高养殖产量、系统中随饵料输入的氮只有部分被鱼类所摄取，剩余部分则直接进入水体；由于鱼类对营养成分固有的同化效率，加之所摄入的相当部分又以排泄物形式进入池塘，故养殖水体中氮负荷明显增加，水质易受污染，鱼类赖以生存的生态环境易遭受破坏［11］。氮是养殖水体中一种影响初级生产力大小的营养元素，对鱼类的生产影响很大。在养殖水体中，氮以分子态氮、无机态氮及有机态氮（如尿素、氨基酸、蛋白质）的形式存在［12］。如3号试验塘施光合细菌后，其底泥中总氮为2．764mg／L，比14号对照塘（3．485mg／L）低0．721mg／L。

3．6光合细菌对养殖水体的生物修复作用

光合细菌广泛分布于在海洋、湖泊、江河、水田、污泥、土壤等各个角落，由于它具有独特的生理生态学特性，使它在净化水质方面的应用越来越被科学界重视，成为世界微生物学界关注的热点。在水产养殖高温季节，养殖池塘中往往出现蓝绿藻大量繁殖，频繁出现“水华”现象，鱼类的生长环境受到严重影响［13］。为此，在施光合细菌进行养殖水体生物修复的基础上，还应适当施肥、适时注水、合理使用增氧机。

4光合细菌施用技术

4．1对温度的适应范围

适宜水温为15～41℃，最适水温为28～36℃。因而宜掌握在水温20℃以上时施用，即在每年的5—9月份期间，以晴天上午泼洒最好，一般阴雨天勿用。生产实践中，应尽可能注意使用的连续性，因为光合细菌在水体中只有形成优势群落，才能发挥最大的作用。

4．2对肥水弱碱性水体使用

光合细菌要根据水质肥瘦情况使用。水肥时施用光合细菌可促进有机污染物的转化，避免有害物质积累，改善水体环境和培育天然饵料，保证水体溶氧；水瘦时要先施肥再使用光合细菌，这样有利于保持光合细菌在水体中的活力和繁殖优势，降低使用成本。施用光合细菌的次数也要视水质而定，水质好可每隔15d施1次。水质较肥，水质较差，特别是饲养后期的高产池，可隔7～10d施1次。此外，酸性水体不利于光合细菌的生长，应先施用生石灰，调节pH值至微碱性时再使用光合细菌。

4．3用量要适当

光合细菌用于鱼池水质净化时，水温20℃以上期间，用光合细菌2～5g／m2拌粉碎的干肥泥均匀撒于鱼池，以后每隔15～20d用1～2g／m3（水体）光合细菌对水全池泼洒。用于饲料添加投喂鱼时，以饲料投喂量的1％拌入，直接或加工后投喂。对于培育鱼苗时，在苗种入池前7d全池泼洒，可利于浮游生物生长。

4．4与施肥配合使用效果好

在池塘施用粪肥或化肥时，配合施用光合细菌更为明显。尤其可避免化肥用量过大，水质难以把握的缺点，并可防止藻类老化造成水质变坏。在鱼苗、鱼种培育池施用光合细菌与粪肥配合使用，增产效果更明显。

4．5注意事项

要避免与消毒杀菌剂混施。水体消毒3～7d后可施用光合细菌。在水体已使用光合细菌后不宜马上泼洒杀菌剂。光合细菌主要用于养水、防病，而非用于治病。对于酸性水体施用生石灰调节酸碱度时，宜过2h后再施用光合细菌；光合细菌菌液拌入饲料使用时宜现拌现喂，当天投完为好。

篇2：注射用鹿瓜多肽细菌内毒素检查方法

[摘要]目的研究注射用鹿瓜多肽对细菌内毒素检查实验的干扰情况,并建立其细菌内毒素检查的质量标准。

方法参照《中国药典》版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法进行试验,用二个不同厂家的鲎试剂对注射用鹿瓜多肽进行干扰试验研究。

结果注射用鹿瓜多肽稀释成≥ 25倍时对细菌内毒素检查无干扰作用。

结论用细菌内毒素检查法(凝胶法)检测注射用鹿瓜多肽热原是可行的。

[关键词]细菌内毒素; 注射用鹿瓜多肽; 鲎试剂

注射用鹿瓜多肽为注射用无菌粉末,常用于静脉滴注,现标准规定用热原法检查 ,但其影响因素多,检验成本大,耗时长。

为此,笔者探讨注射用鹿瓜多肽的细菌内毒素检查法,来代替热原检查法,其实验方法如下。

1仪器与试剂

1.1样品注射用鹿瓜多肽批号:1152、20091046、20090935,规格8mg ,生产企业:黑龙江迪龙制药有限公司; 注射用鹿瓜多肽批号090622、090714、090806,规格8mg, 生产企业:黑龙江江世药业有限公司。

1.2 试剂细菌内毒素工作标准品(批号:150601-200965,规格180EU/ml,中国药品生物

制品检定所);鲎试剂(TAL):灵敏度0.25EU/ml,批号1002090, 湛江博康海洋生物有限公司; 0.25EU/ml 090416,湛江安度斯生物有限公司;细菌内毒素检查用水(BET水),内毒素≤0.003EU/ml,批号W 04, 中国药品生物制品检定所)

1.3 仪器:ZH-2型旋涡混匀器;101-3型电热恒温干燥箱; ET-96型内毒素凝胶法测定仪。

2方法与结果

2.1热原检查按热原检查法[1]操作,以上所取各生产企业的每批样品热原检查均符合规定。

2.2TAL标示灵敏度(λb)复核按细菌内毒素检查法[2]操作,各批TAL灵敏度标示符合规定。

2.3限值(L)的确定[2]按公式L=K/M确定,注射剂K为5EU/(kg・h);注射用鹿瓜多肽最大注射剂量为每次24mg,按60kg成人标准体重,1h最快给药速度计算,即:L=K/M=12.5EU/mg

2.4注射用鹿瓜多肽细菌内毒素限值为12.5EU/mg,对应灵敏度0.5～0.03 EU/ml的鲎试剂,按公式计算,对应的有效稀释倍数分别为25倍、50倍、100倍、200倍。

2.5取注射用鹿瓜多肽样品,用BET水稀释成1:25、1:50、1:100、1:200、倍系列浓度,记此系列溶液为Sw;另制备同样稀释倍数并含有2λ浓度内毒素系列的样品溶液,记此系列溶液为SE。

选择两个鲎试剂生产企业,灵敏度均为λ=0.25EU/ml的TAL,分别与SW和SE两个系列稀释液反应,依次记为NPC和PPC,正式进行注射用鹿瓜多肽干扰试验预试验,试验重复2管,另分别设PC、NC管各2支,分别做阳性和阴性对照。

结果见表1。

对另一厂家3个批号的注射用鹿瓜多肽的干扰试验预试验,都得出以上相同结论,因此可初步确定注射用鹿瓜多肽的最小不干扰稀释倍数为25倍,可在此浓度下进行干扰验证试验。

2.6干扰试验从预试验结果可知, 注射用鹿瓜多肽在稀释到50倍时可排除干扰,以细菌内毒素检查用水及注射用鹿瓜多肽50倍的稀释液,分别将细菌内毒素工作标准品配成浓度为2.0λb,1.0λb,0.5λb,0.25λb4个浓度的溶液(分别称X系列和Y系列),同时两个系列分别以细菌内毒素检查用水和注射用鹿瓜多肽50倍的稀释液作阴性对照(NC)。

以两个不同企业,灵敏度均为0.25EU/ml的TAL,进行干扰试验[2]。

结果见表2。

结果表明注射用鹿瓜多肽稀释50倍后,消除了对鲎试剂与细菌内毒素反应的抑制作用。

供试品的λ值均在0.5～2.0λb(0.125～0.5 EU/ml)

因此,在进行该品种的细菌内毒素检查时可选用的鲎试剂最大的灵敏度:λ= 0.125EU/ml。

同时,用以上方法和试剂对注射用鹿瓜多肽100倍的稀释液进行干扰验证,其结果为Et=Es=λb,证明无干扰。

2.7 注射用鹿瓜多细菌内毒素检查按《中国药典》20版二部附录XIE中细菌内素素检查法,使用二批不同厂家的鲎试剂分别对样品进行细菌内毒素检查,并同时设立样品的自身对照管,结果见表3

3讨论

注射用鹿瓜多肽对鲎试剂与细菌内毒素的反应无干扰作用。

干扰试验结果证实, 注射用鹿瓜多肽在稀释倍数≥25倍时,对灵敏度在0.5～2.0λb(0.125～0.5 EU/ml)的鲎试剂无干扰作用,因此注射用鹿瓜多肽用细菌内毒素检查法是可行的。

按细菌内毒素检查法[2]进行检查,每1mg本品中含细菌内毒素量应小于12.5EU/mg。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中国药典版二部附录ⅪD・北京:化学工业出版社,2005.85.

[2] 国家药典委员会.中国药典2005版二部附录ⅪE・北京:化学工业出版社,2005.85.

[3] 刘婉.注射用更昔洛韦细菌内毒素检查法的实验研究[J].中国实用医药2008, 3(27): 69-71.

[4] 张云平,陈启钊. 注射用血栓通细菌内毒素检查方法的探讨[J]. 中国药师, ,13(3).

篇3：注射用鹿瓜多肽细菌内毒素检查方法

【摘要】目的研究用细菌内毒素检查方法替代鲎试剂法。

方法对药厂生产的注射用盐酸格拉斯琼氯化钠采用试剂检查细菌内毒素。

结果细菌内毒素检查的方法比鲎试剂动物检查的方法更安全、灵敏。

结论用该方法使结果更安全、准确。

【关键词】格拉斯琼氯化钠;细菌内毒素;动物实验

1 一般资料

注射用盐酸格拉司琼氯化钠， (新疆制药厂生产，批号：06120621、06120631、06121641)， (热源检查均符合规定)，规格：50ml/瓶：注射用盐酸格拉司琼(以 C18H24N4O计)3mg与氯化钠。

鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司，批号： 06120521、06120621、06120631，规格：0.1ml/支，灵敏度：0.25EU/ml。

)细菌内毒素标准品：由中国药品生物制品检定所，批号：-10，效价：160EU/A，细菌内毒素检查用水(BET水)：湛江博康海洋生物有限公司生产，批号：0603182，规格50ml/瓶。

2 方法与结果

2. 1 鲎试剂灵敏度复核，按《中国药典》[1]2005年版细菌内毒素检查方法的要求：结果，鲎试剂的灵敏度复核规定均在(0.5～2.0)λ之间符合规定。

表1 鲎试剂灵敏度复核试验结果。

由表 1 可见3批鲎试剂均在(0.5～2.0)λ之间，由此鲎试剂灵敏度均符合规定，可见于细菌内毒素检查，标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

2. 2 供试品内毒素限值(L)的确定，《中国药典》[1]2005版二部附录采用细菌内毒素检查方法，根据公式 L=K/M 确定供试品的内毒素限值。

式中L为供试品的细菌内毒素的限值，以EU/ml考虑到合并用药因素，供试品细菌内毒素限值 L为0.25EU/ml。

2. 3 供试品最大有效稀释倍数的确定，采用公式 MVD=CL/λ确定供试品最大不干扰浓度。

根据公式MVD=CL/λ，选用市售鲎试剂灵敏度标示值为0.25 EU/ml。

来确定供试品注射用格拉斯琼氯化钠的最大不干扰浓度MVD=CL/λ=2 。

2. 4 干扰预试验，细菌内毒素检查用水对供试品2倍的稀释，取供试品(原液)及1：2稀释的供试品溶液，将细菌内毒素工作标准品逐一稀释，稀释的倍数是1倍、2倍、4倍、8倍、把结果设立阴性和阳性的对照，并且做阴、阳性对照(各2管)，表明原液对鲎试剂有干扰，供试品稀释后对鲎试剂试验无任何干扰。

见表2。

2. 5 供试品干扰试验，用两个厂家的灵敏度为0.25EU/mg，制成细菌内毒素标准品分别含内毒素(2.0、1.0、0.5、0.25)λ浓度的溶液。

分别平行做4管，并且做细菌内毒素检查用水和供试品的溶液为(1：2)分别做2管比较，并计算以样品稀释液配制的细菌内毒素溶液反应到终点浓度几何均值(Et)观察结果，表明ES在(0.5～2.0)λ之间， Et在(0.5 s～2.0) Es之间，表明该注射液的2倍稀释液对鲎试剂试验没有产生干扰作用。

供试品的细菌内毒素取三批注射用盐酸格拉斯琼依次加入细菌内毒素检查用水制成每1ml中含格拉斯琼30μg的溶液，按《中国药典》2005年版检查法进检查，每1ml中含内毒素的量应(﹥0.25EU)。

见表3。

表 3供试品干扰试验结果。

3 讨论

本文主要通过干扰试验预试验，取3批注射用盐酸格拉斯琼氯化钠溶液2倍稀释液对细菌内毒素检查无干扰。

用细菌内毒素检查法代替热原检查法是合理的，表明用细菌内毒素检查方法控制内毒素的方法是可行的。

参考文献

[1] 国家要点委员.中华人民共和国药典(二部).2005年版、北京：化学工业出版社， 2005.

注射用葛根素的细菌内毒素检查法可行性【3】

[摘要] 目的:对注射用葛根素进行凝胶法干扰试验,建立注射用葛根素的细菌内毒素检查试验方法。

方法:采用《中国药典》2005年版二部附录收载的细菌内毒素检查法。

结果:注射用葛根素稀释至浓度1.5 mg/ml时对细菌内毒素检查法无干扰作用。

结论:使用细菌内毒素检查法检查注射用葛根素中的细菌内毒素是可行的,可用细菌内毒素检查法代替家兔热原检查法。

[关键词] 注射用葛根素;细菌内毒素;凝胶法;干扰试验

葛根素是从豆科植物野葛干燥根中提取的单体,为异黄酮类化合物,临床及基础研究证明,该药具有扩张冠状动脉和脑血管、降低心肌耗氧量、改善心肌收缩功能、促进血液循环等药理作用[1-2],临床上现已用于治疗心脑血管及外周血管疾病[3-4]。

该品种国家药品标准WS1-(X-388-1)-Z进行热原检查[5],未进行细菌内毒素检查。

为考察该品种是否可以用细菌内毒素检查法来代替热原检查法,本文参照《中国药典》2005年版二部附录收载的细菌内毒素检查法对注射用葛根素进行了细菌内毒素检查研究。

1 仪器与试药

注射用葛根素(批号:08020301,规格:0.2 g/瓶,华北制药集团制剂有限公司;批号:20061222,12131,规格:100 mg/瓶,北京赛生药业有限公司;批号:20060522,200711303,规格:50 mg/瓶,北京赛生药业有限公司;批号:07102801,规格:0.4 g/瓶,山东瑞阳制药有限公司;批号:07121101,规格:0.2 g/瓶,山东瑞阳制药有限公司;批号:07100401, 规格:0.1 g/瓶,山东瑞阳制药有限公司;批号:07091602,规格:50 mg/瓶,山东瑞阳制药有限公司);鲎试剂(批号:0807022,规格:0.1 ml/支,标示灵敏度:0.25 EU/ml,湛江安度斯生物有限公司;批号:080506, 081012,规格:0.1 ml/支,标示灵敏度:0.25 EU/ml,厦门市鲎试剂实验厂有限公司鲎试剂);细菌内毒素工作标准品(批号:150601-200860,规格:160 EU/支,中国药品生物制品检定所);细菌内毒素检查用水(批号:0801180,规格:50 ml/支,湛江安度斯生物有限公司);漩涡振荡器(IKA-MS-1);恒温水浴箱(德国Julabo 19A)。

2 方法与结果

2.1 鲎试剂标示灵敏度的复核[6-7]

根据鲎试剂灵敏度的标示值,将细菌内毒素工作标准品用BET水溶解,在漩涡振荡器上混匀15 min,然后制成2.00λ、1.00λ、0.50λ和0.25λ 4个浓度的内毒素标准溶液,按《中国药典》2005年版二部附录的细菌内毒素检查法规定,对湛江安度斯生物有限公司和厦门市鲎试剂实验厂有限公司两个厂家的鲎试剂进行灵敏度的复核,鲎试剂灵敏度的测定值(λc)=lg-1(∑X/4),式中X为反应终点浓度的对数值(lg),结果见表1。

3批鲎试剂灵敏度分别为0.25 EU/ml、0.25 EU/ml和0.42 EU/ml,均在0.5 λ～2.0 λ范围之间,表明3批鲎试剂灵敏度均符合规定,可用于细菌内毒素检查。

表 1 鲎试剂灵敏度复核结果

Tab.1 The results of tachypleus amebocyte lysate sensitivity test

2.2 注射用葛根素的细菌内毒素限值(L)的确定[6-7]

按《中国药典》2005年版二部中细菌内毒素检查法的规定确定细菌内毒素限值。

根据公式L=K/M,式中L为供试品的细菌内毒素限值,K为按规定的给药途径,人用每公斤体重每小时最大可接受的.内毒素剂量,注射剂K=5 EU/(kg・h),M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量,人均体重按60 kg计算,注射时间若不足1 h,按1 h计算。

从注射用葛根素的产品使用说明书可知本品的最大用药剂量为600 mg,人均体重以60 kg计,滴注时间按1 h计算, 则M=600 mg/60 kg・h=10 mg/(kg・h),L= K/M =[5 EU/(kg・h)]/[10 mg/(kg・h)]=0.5 EU/mg。

本品为心血管药、儿童老人用药,根据《注射剂安全性检查法应用指导原则(修订稿)》的要求安全系数定为3,本品内毒素最终确定限值为L=0.17 EU/mg。

2.3 注射用葛根素的干扰预试验稀释倍数的确定[8-9]

目前用于药品检验的市售鲎试剂灵敏度(λ)一般在0.50～0.03 EU/mg范围内,最小有效稀释浓度c=λ/L,L=0.17 EU/mg,故注射用葛根素进行细菌内毒素检测时,0.50～0.03 EU/mg的鲎试剂相对应的最小有效稀释浓度为3.00、1.50、0.75、0.38、0.18 mg/ml。

2.4 干扰预试验试验[8-9]

取3批注射用葛根素(批号:08020301,规格:0.2 g/瓶;批号:200711303,规格:50 mg/瓶;批号:07121101,规格:0.2 g/瓶)各1瓶,分别加BET水适量溶解,制成50 mg/ml的供试品原液,用BET水将供试品原液进行倍比稀释,制得3.00、1.50、0.75、0.38、0.18 mg/ml共5个浓度梯度的溶液,将此系列浓度溶液标记为供试品管(NPC系列),用上述稀释液作为溶剂,溶解并稀释细菌内毒素工作标准品,制得每个稀释度中细菌内毒素含量均为2 λ(0.5 EU/ml)的注射用葛根素溶液,标记此系列溶液为供试品阳性对照管(PPC系列)。

取灵敏度为0.25 EU/ml的湛江安度斯生物有限公司和厦门市鲎试剂实验厂有限公司两个不同厂家的鲎试剂进行试验,每一稀释度做2管,同时按常规分别设细菌内毒素阳性对照(PC)和检查用水阴性对照(NC)各2管,结果见表2。

表 2 注射用葛根素干扰预试验结果

Tab.2 The results of prerliminary interference test of

Puerarin for Injection

由表2结果可知,所用的3批注射用葛根素稀释到3.0 mg/ml浓度的溶液时,有2批样品对湛江安度斯生物有限公司的鲎试剂与细菌内毒素反应有干扰作用,稀释到1.5 mg/ml或以下浓度的溶液时,对两个厂家的鲎试剂与细菌内毒素反应无增强或抑制的干扰作用。

2.5 干扰试验[6-7]

用两个厂家的鲎试剂(灵敏度为0.25 EU/ml),按《中国药典》2005年版二部附录的细菌内毒素检查法进行试验,测定用BET水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(Es)和用供试品稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(Et)。

取3批注射用葛根素(批号:08020301,200711303,07121101)各1瓶,分别加BET水适量溶解,制成50 mg/ml的供试品原液,再用BET水稀释制成浓度为1.5 mg/ml的供试品稀释液,用BET水和供试品稀释液将细菌内毒素工作标准品稀释成2.00 λ、1.00 λ、0.50 λ、0.25 λ浓度的BET水系列细菌内毒素溶液和供试品稀释液系列细菌内毒素溶液,每一稀释浓度重复4管,同时用上述供试品稀释液和BET水各做2管阴性对照管,按公式计算BET水和供试品稀释液反应终点浓度的几何平均值(Es和Et),Es=lg-1(∑Xs/4),Et=lg-1(∑Xt/4),结果见表3。

表 3 注射用葛根素的正式干扰试验结果

Tab.3 The results of interference test of Puerarin for Injection

由表3结果可知,2 λ管均为阳性,0.50 λ、0.25 λ管均为阴性,对于λ=0.25 EU/ml的2组鲎试剂的Es分别为0.25 EU/ml、0.35 EU/ml,Es均在0.5λ～2.0 λ范围内,3批注射用葛根素测得的Et均在0.5 λ～2.0 λ范围内,Et和Es的比值在0.5～2.0范围内,说明注射用葛根素在1.5 mg/ml或以下浓度的溶液对两个不同厂家的鲎试剂与内毒素的反应无增强或抑制的干扰作用,符合《中国药典》2005年版二部对细菌内毒素检查有效性的规定,因此可以确定注射用葛根素的最大无干扰浓度为1.5 mg/ml。

2.6 注射用葛根素的细菌内毒素检查

取9批注射用葛根素样品,分别根据“2.5”项下方法制成供试品稀释液,使用λ=0.25 EU/ml的两个厂家的鲎试剂进行细菌内毒素检查,并用此稀释液将细菌内毒素工作标准品稀释为2 λ的溶液,作为供试品的阳性对照,另外以细菌内毒素检查用水建立阳性对照和阴性对照。

按《中国药典》2005年版二部细菌内毒素检查法检查,结果见表4。

由表4结果可知,阴性对照管(NC)均为阴性,供试品阳性对照管(PPC)和阳性对照管(PC)均为阳性,实验有效;供试品管(NPC)均为阴性,表明样品中未检出细菌内毒素,9批注射用葛根素的细菌内毒素检查均符合规定。

3 结论

3.1 无干扰浓度确定

干扰试验目的是评价样品浓度对鲎试剂与内毒素凝集反应的干扰程度及干扰性质,初步筛选出对细菌内毒素检查无干扰的样品浓度范围。

本品通过将注射用葛根素稀释至1.5 mg/ml或以下浓度,消除对鲎试剂凝集反应的干扰。

3.2 鲎试剂的影响

不同厂家的鲎试剂由于生产工艺、质量参数等方面有一定差异,其抗干扰能力存在差异。

因此,本实验采用2个不同厂家的鲎试剂对3个批号的样品进行实验。

从正式干扰试验结果可见,样品稀释至1.5 mg/ml浓度时,Es或Et均在0.5 λ～2.0 λ范围之内,可认为注射用葛根素在该浓度下不干扰细胞内毒素检查。

3.3 检查结果

用两个厂家鲎试剂与9批样品进行细菌内毒素检查,样品中细菌内毒素限量均在0.17 EU/mg限值以下。

因此,注射用葛根素采用限值0.17 EU/mg进行细菌内毒素检查法代替热原检查法是可行的。

[参考文献]

[1]白东义,佟春玲,韩慧,等.葛根素的药理作用及其临床应用研究进展[J].江苏中医药,2009,41(3):76-78.

[2]姚丹,丁选胜.葛根素药理作用机制探讨及临床应用[J].中国临床药理学与治疗学,2008,13(4):468-474.

[3]刘绍德,莫惠平.葛根素注射液的不良反应及预防[J].中国中西医结合杂志,2005,25(9):852-855.

[4]张新广,王冬梅.葛根素提取工艺的研究[J].中药材,,27(9):680.

[5]国家药典委员会.国家药品标准新药转正标准第46册[M].北京:化学工业出版社,2004:26-27.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].二部.北京:化学工业出版社,2005:附录85-88.

[7]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国医药科技出版社,2005:287-297.

[8]王慧明,陈邦树.胞磷胆碱钠注射液细菌内毒素检查法[J].中国药师,2005,8(9):793

[9]潘正兴,宋勤.注射用奥美拉唑钠细菌内毒素检查法[J].药物分析杂志,2008,28(2):275-277.

篇4：黄梅县实验小学安全检查自查报告

县教育局：

现将检查情况和整改措施报告如下：

一、安全隐患

（1）逸夫楼楼梯地面平滑。

（2）通往家属区电线部分裸露。

二、整改措施

（一）逸夫楼楼梯地面平滑整改措施。

1）学习《实验小学安全工作责任状》、《实验小学安全工作管理条例》，明确目标责任。

2）组织具体人员到位。

每天行政值日人员在上午放学、下午放学到楼梯口，管理安全、维护学生下楼、禁止家长上楼。

每天上午、下午最后一节课老师，组织带领本班学生有秩序地下楼。

每天课余时间，安排安全小卫士值班，管理学生在楼梯安全。

（二）通往老家属区部分线路裸露整改方案。

10月26、27日，由总务处已安排水电管理员更换了新电线。

黄梅县实验小学

篇5：黄梅县实验小学安全检查自查报告

黄梅县实验小学安全检查自查报告 -自查报告

黄梅县实验小学安全检查自查报告