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篇1：恶性疟原虫PfRNaseⅡ的克隆表达与降解特性的性状分析论文
恶性疟原虫PfRNaseⅡ的克隆表达与降解特性的性状分析论文
在真核生物中，DNA转录生成RNA，然而其中只有极少部分的RNA 编码蛋白质，大部分基因组序列转录生成非编码RNA (ncRNA)。ncRNA根据其功能的不同可分为持家ncRNA和调节ncRNA，其中调节ncRNA曾被认为是转录“噪音”。随着测序技术的发展，越来越多的研究表明ncRNA可在转录、转录后以及表观遗传等水平调控基因的表达，从而参与机体的生长发育、疾病发生以及病原体毒力相关基因的表达等过程。尽管RNA 在生物体中发挥重要作用，然而RNA的新陈代谢离不开核糖核酸酶特别是核糖核酸外切酶的参与。研究表明核糖核酸外切酶与病原体的毒力表型有关，其机制尚不清楚，可能与核糖核酸外切酶参与RNA的加工、降解、稳定等过程有直接或间接的联系。恶性疟原虫是疟疾的主要病原体之一，致病力强，致死率高，对人类的危害严重。
张青锋等研究发现恶性疟原虫中存在一种核糖核酸外切酶PfRNaseⅡ，该酶通过降解新生RNA 从而介导与重症疟疾相关的毒力基因(upsA 亚类基因)的沉默。
本实验通过体外扩增恶性疟原虫3D7株PfRNaseⅡ的催化活性区，构建重组表达载体，然后利用原核表达系统诱导表达GST标签融合蛋白质，纯化后进行RNA降解活性测定，为解析PfRNaseⅡ基因结构组成及其降解机制研究奠定基础。
材料与方法
1材料
1.1虫株与菌株大肠埃希菌DH5α、BL21-Codon-Plus(DE3)和恶性疟原虫3D7虫株均由本室保存。
1.2主要试剂ExTaq? DNA 聚合酶，dNTP，DLTMDNAMarker，DL15000TMDNAMarker，限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ，T4DNA 连接酶，pMDTM18-TVectorCloningkit均购自于大连宝生物公司;Glutathione-SepharoseTM4B 购于美国GEHealthcare公司;GST-tagMousemAb购自于天津三箭生物有限公司;碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG和BCIP/NBT购于美国Sigma公司;DNAGelExtractionKit和PlasmidMiniprepKit购于美国BIOMIGA公司;其他试剂均为国产或进口分析纯。
2方法
2.1序列分析与引物合成根据疟原虫专业网站(www.plasmoDB.org)提供的序列信息，对恶性疟原虫3D7株PfRNaseⅡ (PF3D7_0906000)基因编码区进行保守结构域分析，显示该蛋白质氨基酸序列的870～1322区段为RNBdomain，该结构域是RNaseⅡ的特征性结构域和催化活性区。根据编码序列设计特异性引物，并在引物的5'端分别添加酶切位点。上游引物：5′-GGATCCTTAGAAAAATATATGTTGAAAAGCT-3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点序列)，下游引物：5′-GAATTCAATATTATCTTGATCAATTAAACTTTGT-3′(划线部分为EcoRⅠ酶切位点序列)。引物由长春库美生物公司合成。
2.2目的片段的扩增以cDNA(本室保存)为模板，PCR扩增上述的目的基因片段。PCR 反应程序：94℃预变性4min;94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环;72℃再延伸10min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2.3重组表达载体的构建取PCR产物与pMD18-T载体连接，连接产物转入DH5α后涂板，经PCR、测序鉴定为阳性的重组pMD18-T-PfRNaseⅡ载体质粒与原核表达载体pGEX-4T-1质粒分别进行BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切(37℃酶切反应2.5h)，酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离后，按BIOMIGA试剂盒说明书切胶回收。将回收的载体片段与目的片段按摩尔比5︰1混合，在T4DNA连接酶的作用下于16℃水浴连接过夜，连接产物转入DH5α后涂板，经PCR、双酶切、测序鉴定正确的重组表达载体质粒pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ转入BL21-CodonPlus(DE3)中。测序鉴定均由哈尔滨博仕生物公司完成。
2.4融合蛋白质的诱导表达与纯化将转染pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ的DE3划线接种于固体LB培养基中37℃培养12h以上，挑取单个菌落接种于5ml液体LB中扩大培养。取适量菌液按1︰100接种继续扩大培养，当A600值为0.6左右时，加入终浓度为100μmol/LIPTG诱导表达目的蛋白质。于16℃诱导表达12h后收集菌体，用适量TBS重悬，然后加入终浓度为1% TritonX-100和2mmol/L的PMSF混匀，超声破碎菌体。用Glutathione-SepharoseTM4B树脂纯化目的蛋白质pGEX-PfRNaseⅡ。以相同的流程纯化GST标签蛋白质。纯化的目的蛋白质用预冷的'Tris缓冲液(TBS)透析，按说明书操作。为了便于PfRNaseⅡ的水解活性测定，在纯化pGEX-PfRNaseII融合蛋白质和GST 标签蛋白质时，全程尽量避免PO43-污染，故用TBS替换PBS。纯化的目的蛋白质通过SDS-PAGE和Westernblot鉴定其浓度和纯度。
2.5pGEX-PfRNaseⅡ水解活性测定反应体系为12.5μl，包含终浓度为0.8μmol/LpGEX-PfRNaseⅡ，20 mmol/LTris-HCl (pH =8.0)，100mmol/LKCl，5mmol/LMg2+，1U/μlRNasin和4μmol/L单链RNA(ssRNA)或2μmol/L双链RNA(dsRNA)。同时设置等摩尔数的GST标签蛋白为阴性对照。37℃孵育适当时间后加入等量含30mmol/LEDTA的上样缓冲液终止降解反应。反应终产物进行20%7mol/L尿素变性聚丙烯酰胺凝胶(7mol/LU-PAGE)电泳检测。ssRNA 和dsRNA 均由苏州吉玛公司合成。
2.6观察镁离子对pGEX-PfRNase Ⅱ 体外降解RNA的影响有研究表明，核糖核酸外切酶降解RNA需要二价金属离子的参与。为了观察Mg2+对pGEX-PfRNaseⅡ体外降解RNA 的影响，本实验设置0～20mmol/L梯度浓度的Mg2+ 进行目的蛋白RNA水解活性测定定，反应体系中的其他成分与方法2.5一致。
结果
1目的片段的扩增以cDNA 为模板，利用PCR 方法扩增PfRNaseⅡ的RNB催化区(870～1322位氨基酸区段)的编码基因，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，大小在1000～2000bp之间，与预期值(1404bp)相符，不含内含子的编码区片段扩增成功。
2重组pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ表达载体的构建及鉴定按常规方法构建pMD18-T-PfRNaseⅡ重组T载体质粒和pGEX-4T-1 表达载体质粒，BamHⅠ 和EcoRⅠ双酶切结果。回收载体和目的基因片段，于16℃连接过夜，构建重组pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ表达载体，经PCR、双酶切、测序鉴定均正确，重组表达载体构建成功。
3目的蛋白质的表达纯化及鉴定
pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ转染DE3后用终浓度为100μmol/LIPTG诱导12h，成功表达目的蛋白。纯化的pGEX-PfRNaseⅡ融合蛋白和GST标签蛋白的SDS-PAGE结果。以GST-tagMousemAb为一抗，碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG 为二抗，进行Westernblot，目的蛋白能被相应一抗识别。根据SDS-PAGE 结果估计融合蛋白pGEXPfRNaseⅡ浓度约为80μg/ml，GST标签蛋白质浓度为500μg/ml。
4pGEX-PfRNaseⅡ的水解活性
将pGEX-PfRNaseⅡ与ssRNA 混合后于37 ℃孵育30min即可见明显的降解发生，等量的GST标签蛋白与等量的ssRNA在37℃孵育120min后仍无明显的降解发生。在同等条件下，pGEX-PfRNaseⅡ和GST标签蛋白均不能降解dsRNA。
5二价金属离子对pGEX-PfRNaseⅡ催化活性的影响
为了确定Mg2+ 对PfRNaseⅡ酶活性的影响，实验设置0(EDTA组)、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、20mmol/L共10个Mg2+ 梯度。在不同Mg2+ 条件下，pGEX-PfRNaseⅡ与ssRNA 在37 ℃孵育90min后经20%7mol/LU-PAGE检测，呈现不同的降解效果。在低浓度Mg2+ 条件下，pGEX-PfR-NaseⅡ降解活性较强;而在EDTA的存在下，pGEXPfRNaseⅡ的活性受到明显抑制。表明Mg2+ 为pGEX-PfRNaseⅡ发挥降解活性所必需，且在低浓度时活性较强，高浓度时活性受到抑制。
讨论
疟疾是由疟原虫感染引起的寄生虫病，通过受感染的蚊虫叮咬传播。世界卫生组织最新报告显示，全球大约有32亿人口仍处于疟疾感染的威胁下，仅就新增加2亿感染病例和40多万的死亡病例。虽然人类的抗疟行动取得了一定成绩，但随着虫体耐药性的产生和扩散，研制开发有效的疫苗和新型抗疟药物刻不容缓。解析疟原虫的抗原变异机制和关键毒力基因的调控机制，对研制新型疟疾疫苗或药物具有重要意义。
大量研究证实，由Var基因家族编码的恶性疟原虫红细胞膜抗原1(PfEMP1)是虫体抗原变异的主要效应分子，也是介导细胞粘附和玫瑰花环形成的重要致病因子，在恶性疟原虫免疫逃避和虫体致病中发挥重要作用。因此，Var基因的调控机制一直是疟疾研究领域的重点和热点。虽然关于Var基因的调控已经在转录水平和表观遗传水平取得一定的进展，但关于Var基因完整的调控网络尚不十分清楚。Zhang等报道恶性疟原虫PfRNaseⅡ通过降解新生的RNA介导与重症疟疾相关的毒力基因，首次从转录后水平研究Var基因的调控机制，这对完善Var基因的调控机制具有重要意义。
生物信息学分析PfRNaseⅡ序列发现，该蛋白870～1322氨基酸残基区段为RNB结构域。RNB结构域是RNB家族成员特征性的功能结构域，属保守功能域，而RNB家族成员又是核糖核酸外切酶的重要组成部分。本研究利用原核表达系统制备含PfRNaseⅡ预测的RNB功能区的GST 标签融合蛋白。体外RNA 降解试验显示该蛋白可水解ssRNA 而不能水解dsRNA，且其降解ssRNA的活性受反应体系中Mg2+ 浓度的影响。可见，PfRNaseⅡ具有ssRNA水解活性，其水解反应需要二价金属离子的参与，为PfRNaseⅡ的降解机制及其在疟原虫生长发育中的作用研究奠定了基础。
篇2：水稻花药绒毡层特异表达基因RA39的克隆与表达特性分析
水稻花药绒毡层特异表达基因RA39的克隆与表达特性分析
利用cDNA减法杂交、差异杂交筛选和RACE等技术,从水稻(Oryza sativa L. ssp. japonica)中克隆了一个新的绒毡层特异性cDNA,其编码基因被命名为RA39.该cDNA长1 013 bp, 编码由298个氨基酸残基组成的多肽.RA39是一个单拷贝基因,在绒毡层细胞中特异性表达,在小孢子母细胞减数分裂期的绒毡层细胞中有较高的`表达活性.用PSORT和PPSEARCH软件进行的结构分析揭示出RA39蛋白的N端是一个由17个氨基酸残基组成的信号肽,该蛋白包含一个跨膜区和一个胞质尾区两个主要结构域以及多个蛋白激酶的磷酸化位点.
作 者：丁兆军 吴孝槐 王台 DING Zhao-Jun WU Xiao-Huai WANG Tai 作者单位：中国科学院植物研究所,北京,100093 刊 名：植物学报 ISTIC SCI英文刊名：ACTA BOTANICA SINICA 年，卷(期)：2003 45(2) 分类号：Q943.2 关键词：水稻 花药 绒毡层特异表达基因 rice anther tapetum-specific gene★ 药理学的学习心得
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