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铜绿假单胞菌增强型绿色荧光蛋白标记的研究

时间：2022-08-23 07:48:07 其他范文收藏本文下载本文

铜绿假单胞菌增强型绿色荧光蛋白标记的研究（共5篇）由网友“横滨黄街灯”投稿提供，小编在这里给大家带来铜绿假单胞菌增强型绿色荧光蛋白标记的研究，希望大家喜欢!

篇1：铜绿假单胞菌增强型绿色荧光蛋白标记的研究

铜绿假单胞菌增强型绿色荧光蛋白标记的研究

根据增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因设计了上下游引物P1和P2,通过对铜绿假单胞菌菌株X3绿色荧光蛋白标记研究,构建了铜绿假单胞菌标记系统,获得带有EGFP标记的'基因工程菌X9,为进行相关的跟踪研究创造了条件.该菌株绿色荧光标记性能稳定.通过转化子基因组DNA PCR 和斑点杂交检测,外源EGFP基因存在于转化子染色体上. 图6 参14

作者：魏明宝崔长征方呈祥张甲耀王海王亚芬 WEI Mingbao CUI Changzheng FANG Chengxiang ZHANG Jiayao WANG Hai WANG Yafen 作者单位：魏明宝,崔长征,张甲耀,王海,王亚芬,WEI Mingbao,CUI Changzheng,ZHANG Jiayao,WANG Hai,WANG Yafen(武汉大学资源与环境科学学院,武汉,430079)

方呈祥,FANG Chengxiang(武汉大学生命科学学院,武汉,430072)

刊名：应用与环境生物学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF APPLIED & ENVIRONMENTAL BIOLOGY 年，卷(期)： 11(1) 分类号：X172:Q78 关键词：铜绿假单胞菌 EGFP PCR 斑点杂交

篇2：分析铜绿假单胞菌的耐药

分析铜绿假单胞菌的耐药

摘要：目的：了解铜绿假单胞菌(PA)医院感染现状及其对抗菌药物的耐药性，为临床医生合理用药提供科学依据。方法：1月-6月某三甲医院分离的1003株铜绿假单胞菌株进行耐药分析，采用法国生物梅里埃VITEK-2 XL全自动微生物鉴定系统，及VITEK-2配套药敏卡片。结果：PA在呼吸道标本中检出率最高，占74.88%，在20种抗菌药物中耐药率小于30%从低到高依次为阿米卡星(2.4%)、妥布霉素(3.9%)、哌拉西林/他唑巴坦(5.9%)、庆大霉素(6.2%)、左旋氧氟沙星和环丙沙星(6.7%)、美洛培南(7.8%)、亚胺培南(7.9%)、头孢吡肟(8.7%)、哌拉西林(9.8%)、头孢他啶(11.7%)、氨曲南(21.2%)。-与-20的PA耐药率比较，差异均有统计学意义(P<0.001)。结论：PA是医院感染重要致病菌，加强监控了解耐药机制及规范用药以减少高耐菌的产生。

关键词：绿假单胞菌; 医院感染：耐药机制

1 资料与方法

1.1 一般资料

1003株菌株来源于201月-年7月笔者所在医院送检标本。送检标本阳性分离率前五位依次为痰液(包括咽拭子，支气管灌洗液)、分泌物、体液、血、尿。

1.2 方法

采用法国生物梅里埃VITEK-2 XL全自动微生物鉴定系统，及VITEK-2配套药敏卡片。

1.3 质控操作

按全国检验操作规程及仪器操作说明书，美国CLSI药敏规则。质控菌株ACTT27853。

1.4 统计学处理

采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，比较采用t检验;计数资料以率(%)表示，比较采用字2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐药监测情况

分离率前5名的标本来源：痰751株(74.9%)，分泌物89株(8.9%)，体液83株(8.31%)，血36株(3.6%)，尿33株(3.3%)。在20种抗菌药物中耐药率小于30%从低到高依次为阿米卡星(2.4%)，妥布霉素(3.9%)，哌拉西林/他唑巴坦(5.9%)，庆大霉素(6.2%)，左旋氧氟沙星和环丙沙星(6.7%)，美洛培南(7.8%)，亚胺培南(7.9%)，头孢吡肟8.7%，哌拉西林(9.8%)，头孢他啶(11.7%)，氨曲南(21.2%)。PA菌的感染主要在呼吸道。详见表1。

2.2 2004-20与2012-2013年的PA耐药率比较

笔者回顾2004-年同家医院的PA感染和耐药性检测，对几种PA常见的抗菌药物比较，差异均有统计学意义(P<0.001)。详见表2。

3 讨论

PA菌感染多继发于不同免疫损伤的基础疾病上，病情复杂，由于抗菌药物在不同的组织内浓度不尽相似，其临床治疗效果决定于感染程度及其部位;PA菌在临床感染中的来源非常广，从机体的深部以至表皮均见其踪影，而以呼吸道的感染最常见，在血流、胸腹腔等体液等危险部位也占一定的比例。本资料显示，PA菌的标本来源以呼吸道为主，其次为分泌物、体液、血液、尿液，其呼吸道感染仍是PA的主要感染方式;常见感染诱因：PA在自然界较为广泛分布，在于人类的皮肤和肠道亦存在，是人体的正常菌群之一。

由于此菌在环境中的广泛存在，因此很容易污染医疗器械而造成感染机会，特别是气管插管或器官切开等，使上呼吸道的过滤功能失去作用;气管纤毛活动减退或消失，削弱了肺免受感染的保护机制，加上机械通气、人工吸痰等操作，使感染的机会大大增加，对于这类高危患者，临床应重视及时对痰标本的收集送检;铜绿假单胞菌败血症也是临床上常见的感染之一，多继发于大面积烧伤、白血病、淋巴瘤、恶性肿瘤、静脉导管、心瓣膜置换术及各种严重慢性疾病等的过程中，本菌引起的败血症约占革兰阴性杆菌败血症7%～18%，居第3或第4位，但其死亡率则是革兰阴性杆菌败血症的首位，应给予高度重视并及时正确的处置。假单胞菌的尿路感染是医院内泌尿道交叉感染的常见菌之一，留置导尿管是截瘫患者获得感染的最常见诱因，其他如神经原膀胱、尿路梗阻，慢性尿路感染长期应用抗菌治疗亦易罹患假单胞菌感染，有资料报道40%的铜绿假单胞菌败血症的原发病为尿路感染。

铜绿假单胞菌的主要耐药机制：耐药机制异常复杂，总括之，主要与以下因素有关：

(1)细菌产生抗菌活性酶，如β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等;

(2)细菌改变抗菌药物作用的靶位，如青霉素结合蛋白(PBPs)、DNA旋转酶等结构发生改变，从而逃避抗菌药物的抗菌作用;

(3)外膜通透性降低;

(4)生物膜形成;

(5)主动泵出系统。

其中主动泵出系统在铜绿假单胞菌多重耐药机制中起着主导作用;抗菌药物的主要作用机理及耐药机制：三四代头孢的耐药与PA菌外膜通透性降低，产β-内酰胺酶，产低亲和力的PBPs有关，氟喹诺酮药[1]，对抗生物膜效果很强，是临床治疗PA的主要药物之一。环丙沙星是氟喹诺酮问世以来，第一个被应用于治疗PA感染的药物，左氧氟沙星是氧氟沙星的左旋异构体，通过阻断细菌DNA合成而达到抑菌的效果。但随着氟喹诺酮类的广泛应用其耐药率也不断增高。有研究表明：喹诺酮类药物的耐药机制主要包括以下几个方面，QRDR基因突变：导致酶结构改变，使药物不能与酶DNA复合物稳定结合;gyrA基因的突变是氟喹诺酮类药物对PA临床分离株的主要耐药机制，parC基因的突变可使耐药性增强;主动外排泵系统的`变异而导致细胞内药物浓度降低;外膜蛋白和脂多糖的变异均能使细菌摄取药物的量减少而导致耐药[2]。

氨基糖苷类药物的耐药机制与氨基糖苷类纯化酶的产生和多重耐药主动外排系统有关，临床常用联合用药方式治疗PA感染，如碳青霉烯类抗生素与氨基糖苷类抗生素或与新一代氟喹诺酮类抗生素合用，可降低MDRP耐药率;加酶抑制剂的β-内酰胺酶类复合抗菌药物[3]在治疗产ESBL的铜绿假单胞菌有较好的效果，碳青酶烯类对β-内酰胺酶的PA抗菌活性很强，耐药率低，但其同时也是一种很强的β-内酰胺酶的诱导剂，其耐药机制与PA产金属酶及细菌的特异性外膜通道蛋白OPrD2丢失有关，耐碳青酶烯类的PA常为多重耐药菌，甚至为泛耐菌，故临床应合理地慎用亚胺培南和美洛培南;耐药监测：本文资料在20种抗生素中，氨苄西林、呋喃妥因、头孢唑林、头孢呋辛钠、头孢呋辛酯、呋喃妥因、复方新诺明的耐药率极高均大于92%，三代头孢中的头孢曲松耐药率也高达84.3%，氨曲南耐药率21.2%，按耐药率低于30%的推荐用药原则，其余抗菌药物可做为推荐用药。

在同家医院不同时期PA对9种抗菌药物的耐药率监测对比资料显示，该院在科学合理用药方面不断地规范和取得明显成效;实验室快速准确的病原菌分离和耐药性监测，有利于指导临床抗生素的正确使用，减少院内感染，节约医疗资源，了解各类抗菌药物作用机制及细菌的耐药机制，有利于防止多重耐药菌和泛耐菌的蔓延和扩散。

参考文献

[1]谢景超.铜绿假单胞菌感染的抗菌药物选择[J].中南药学，2005，3(2)：119.

[2]王燕.铜绿假单胞菌的耐药机制及抗生素应用[J].实用医技杂志，，15(11)：1408-1409.

[3]黄艺云，胡慧文.下呼吸道489株铜绿假单胞菌的耐药分析[J].实验与检验医学，2008，11(6)：714..

篇3：110株铜绿假单胞菌的分离及耐药情况

110株铜绿假单胞菌的分离及耐药情况

铜绿假单胞菌是医院内感染的主要病原菌之一,而且由于抗菌药物广泛、不合理使用及多重耐药菌株的出现,使其耐药性问题日趋严重.现将我院-2007年分离的'110株铜绿假单胞菌的临床分布特征及药敏结果分析报告如下.

作者：王国英作者单位：河北东光县医院检验科,河北沧州,061600 刊名：解放军预防医学杂志 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF PREVENTIVE MEDICINE OF CHINESE PEOPLE'S LIBERATION ARMY 年，卷(期)： 27(1) 分类号：Q939.11 R969.3 关键词：铜绿假单胞菌抗生素耐药性

篇4：铜绿假单胞菌整合子与多重耐药性研究

【摘要】目的在铜绿假单胞菌中检测1类整合子并分析整合子对细菌耐药性的影响。方法用VITEK-AMS 微生物自动分析仪鉴定细菌和药敏试验，用PCR方法扩增I类整合酶基因，经电泳后检测扩增产物。结果 158株铜绿假单胞菌中检测出1类整合子42株，检出率为26.6%。1类整合子阳性菌对氨基糖苷类、喹诺酮类及头孢菌素类药物表现出较高的耐药率。携带1类整合子菌株易表现出对至少4种抗菌素的多重耐药性，其多重耐药率为68.6%(33/48)，明显高于1类整合子阴性菌株(28.6%)，P<0.05。结论 1类整合子广泛存在铜绿假单胞菌中,1类整合子对细菌多重耐药性的产生和传播起着重要作用，应加强临床细菌基因水平的耐药监测，采取有效措施防止耐药性的传播。

篇5：铜绿假单胞菌整合子与多重耐药性研究

铜绿假单胞菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。随着抗生素的广泛使用和不合理使用，使包括铜绿假单胞菌在内的多种细菌的耐药性问题日益严重。

整合子是与细菌耐药性传播有关的基因系统，整合子通过捕捉和整合细菌耐药基因，在细菌耐药性的传播和扩散中起了重要的作用。整合子通过位点特异性的基因重组可整合多种耐药基因对细菌多重耐药的形成起着重要作用职称论文。

本文对158株铜绿假单胞菌进行分析，以探讨铜绿假单胞菌整合子与其多重耐药性之间的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

2009年10月～2010年5月从我院临床标本中分离的铜绿假单胞菌158株。标本分别来自老年病房(53株)、呼吸科病房(49株)、普外科病房(28株)、泌尿科病房(16株)和内分泌病房(12株)。菌株分别分离自痰标本(68株)、脓汁(42株)、咽拭子(18株)、尿标本(12株)、伤口分泌物(10株)和血液(8株)。标准质控菌株为铜绿假单胞菌(ATCC27853)。携带1型整合子铜绿假单胞菌为本实验室分离株经测序证实，作为PCR实验阳性对照。

1.1.2 鉴定卡片

全自动微生物分析仪(VITEK-AMS)采用的GNI鉴定卡、GNS药敏卡均购自法国Biomerievx公司,GNS药敏卡包括氨苄青霉素、庆大霉素、环丙沙星、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、丁胺卡那、复方新诺明、头孢噻肟、亚胺培南11种抗菌药物职称论文。

1.1.3 PCR试剂

TaqDNA聚合酶,4种dNTP混合液,DNA分子标准参照物购自Takara公司;琼脂糖,溴化乙啶等常用分子生物学试剂购自上海生工公司。

1.1.4 主要仪器

VITEK-AMS自动鉴定系统购自法国Biomerievx公司;PCR扩增仪、DNA/RNA/protein analyzer分析仪和高速低温离心机购自德国eppendorf公司;PCR电泳仪为北京崇文东方仪器厂产品;DGW-99型台式高速微型离心机为宁波新芝科器研究所产品。

1.2实验方法

1.2.1 菌株鉴定

所有菌株都用VITEK AMS 分析仪GNI细菌鉴定卡进行菌种鉴定。体外药物敏感试验：采用GNS检测卡测定13种抗菌药物对158株铜绿假单胞菌的MIC值，操作方法按照VITEK AMS规定的方法进行。

1.2.2加热裂解法制备DNA模板

:用Luria-Bertani液体培养基200r/min振荡培养8h获得对数生长期菌株。携带1型整合子铜绿假单胞菌为本实验室分离株经测序证实，作为PCR实验阳性对照。

1.2.3筛选1型整合子阳性菌株

用PCR方法扩增整合子可变区，以整合子上游引物ggcatccaagcagcaagc和整合子可变区下游引物aagcagacttgacctgat，进行PCR扩增。50ulPCR反应体系为:DNA100ng、25mmol/LMgCl2、0.4mmol/LdNTP、0.4pmol/L引物和2.5UTaq酶。PCR反应循环参数设置如下94℃预变性4分钟;94℃45秒，55℃，45秒，72℃3分钟，循环35次;最后72℃延伸10分钟。

1.2.4 PCR反应结束后取产物琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下拍照记录结果。

1.2.5 统计学处理

采用χ2检验，P<0.05有显著差异。统计软件为SPSS10.0。

2 结果

2.1 1类整合子基因检测结果

全部158株铜绿假单胞菌的`DNA上有42株检测到I类整合子，占细菌总数的26.6%。1类整合子的大小分别为600bp、1000bp、1600bp、1900bp和2100bp。根据各株细菌质粒DNA上检测到1类整合子的大小和数目，细菌质粒NDA上的整合子可分为5种整合子谱。

2.2 1类整合子阳性菌株与耐药性的关系

对比1类整合子阳性菌株与阴性菌株对抗菌药物的耐药率，并做统计分析，结果见表1。

1类整合子阴性菌株对11种抗菌药物完全敏感率为54.4%(86/158)。1类整合子阳性菌株更易表现出对青霉素、喹诺酮类、磺胺类药物的耐药。耐药率最高的是复方新诺明(100%)其次为氨苄青霉素(90.5%)和庆大霉素(85.7%)，丁胺卡那也表现出较高的耐药率(76.7%)。1类整合子阳性菌株对6种药物的耐药率显著高于阴性菌株，P<0.05。

2.3 1类整合子与多重耐药率的相关性

多重耐药率(耐4种以上抗生素)为62.0%(98/158)，其中1类整合子阳性菌株多重耐药率占85.7%(36/42)，阴性菌株多重耐药率为20.7%(24/116)。1类整合子阳性菌株多重耐药率明显高于阴性株，差异有统计学意义(χ2=18.23，P<0.01)。

3 讨论

整合子是存在于细菌质粒、染色体或转座子上的一种遗传结构，可以捕获耐药基因，使细菌表现为对抗生素的多重耐药[1]给临床治疗带来极大的困难。整合子本身不能移动，但常作为转座子的一部分或借助可移动性质粒在同种细菌或不同种细菌间播散，造成细菌耐药性的扩大，是细菌多重耐药迅速发展的重要原因。根据整合酶的不同分为6 类[2]在临床分离的菌株中以 1类合子最为常见。1类整合子基本结构由三部分组成,两端为高度保守的序列，分别称作5’CS和3’CS,5’CS和3’CS之间为可变区，可变区由一个或多个外来插入的基因盒组成[3]。在整合酶的催化下.通过位点重组系统整合外来耐药基因，使耐药基因得到不断的累积，从而使细菌具有耐药性和多重耐药性。目前在1类整合子中发现的基因盒已超过80种，大部分是耐药基因盒，编码产物可赋予细菌对几乎全部临床抗生素耐药。